張艷 李倩倩 霍薇

血管性癡呆動物模型的研究現(xiàn)狀

張艷 李倩倩 霍薇

血管性癡呆(vascular dementia，VD)指各種腦血管病引起的獲得性認知障礙，它是癡呆的重要類型，已經(jīng)越來越引起重視。VD相關的實驗動物模型在研究中廣泛應用，包括短暫性全腦缺血模型、永久性全腦缺血模型、局灶性腦缺血模型和腦小血管病模型。本文將這些模型的制備方法、腦組織的病理學變化和認知功能損害的特點等進行綜述，期望對臨床和實驗研究有所幫助。

血管性癡呆；動物模型

血管性認知功能障礙(vascular cognitive impairment，VCI)是指大腦任何血管因素引起的認知功能障礙，主要包括非癡呆性血管性認知功能障礙(vascular cognitive impairment no dementia，VCIND)、血管性癡呆(vascular dementia，VD)和混合型癡呆等，它可以單獨發(fā)生或與Alzheimer病合并出現(xiàn)。為深入研究VCI/VD的發(fā)病機制、病理學改變、認知功能損害的特點和治療措施等，研究者已經(jīng)建立了多種模擬人類疾病特征的動物模型。本文將對這些動物模型的制備方法、腦組織的病理學變化和認知功能損害的特點等進行綜述，期望對VCI/VD的研究有所幫助。

1 短暫性全腦缺血模型

短暫性全腦缺血模型是通過可逆性、短暫性夾閉相應腦血管，或結合動脈放血造成低血壓等方法，制備的全腦缺血模型。該模型對于慢性腦缺血、VD和相關藥物治療等的研究具有實際意義。其缺點在于操作方法對動物全身狀態(tài)影響較大，梗死部位不固定。

1.1 四血管法(four vessels occlusion，4-VO) 四血管法為目前國際公認的VD模型制備方法，也可用于神經(jīng)保護藥物的研究。操作方法：首先分離雙側頸總動脈備用，然后電凝或結扎雙側椎動脈，造成永久性閉塞。實驗中可根據(jù)需要短暫地阻斷雙側頸總動脈，并于一定時間后開放而實現(xiàn)血流再灌注。該方法常用動物為大鼠，也可為猴和兔等。Chung等[1]發(fā)現(xiàn)給予大鼠反復兩次腦缺血再灌注，每次缺血持續(xù)10 min，間隔期為1 h，在術后第7天，經(jīng)八臂迷宮實驗檢測到大鼠的空間工作記憶受損，表現(xiàn)為大鼠對食物在迷宮中的空間位置記憶錯誤，正確找到食物的次數(shù)減少，而錯誤頻率增加。病理學檢查見海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡，皮層和丘腦的少突膠質細胞凋亡。而且海馬和皮層的乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)釋放量顯著減少，ACh水平降低。經(jīng)過反復3次的腦缺血再灌注后，應用八臂迷宮實驗檢測，發(fā)現(xiàn)除了導致大鼠前述的顯著的空間記憶損害外，一些大鼠還會有運動功能障礙[1]。

1.2 三血管法(three vessels occlusion，3-VO) 操作方法：先分離雙側頸總動脈備用，結扎基底動脈，然后用動脈夾夾閉兩側頸總動脈，形成3條動脈阻斷的全腦缺血模型。一定時間后，解除雙側頸總動脈的夾閉，血流再通即形成再灌注。常用動物為大鼠。此法可通過阻斷頸總動脈的時間長短來控制腦缺血程度。Horeck等[2]通過Morris水迷宮檢測，發(fā)現(xiàn)3-VO模型造成大鼠空間學習記憶能力的損害，與二血管法(two vessels occlusion，2-VO)的研究結果相似。因為2-VO模型鼠術后急性腦缺血比較嚴重，采用3-VO模型可以盡量降低急性腦缺血程度，減少對慢性腦缺血病理生理過程的干擾。

1.3 2-VO 操作方法：分離并夾閉雙側頸總動脈，使血流阻斷5 min，同時從尾尖部放血(不超過1 mL/100 g體質量)，然后使血流復通。C57BL/6小鼠的后交通動脈發(fā)育不良，Yamamoto等[3]發(fā)現(xiàn)，采用2-VO法短暫(5 min)阻斷血流，術后第7天通過被動逃避實驗和Y迷宮檢測，可觀察到小鼠的學習功能受損，海馬長時程增強作用受到抑制。2-VO(20 min)可導致海馬CA1區(qū)廣泛的神經(jīng)元死亡。Walker等[4]發(fā)現(xiàn)2-VO方法還會導致腦白質損害，該作者對小鼠全腦缺血再灌注后3 d，在缺血的胼胝體和尾狀核的白質纖維束，可見星形膠質細胞和小膠質細胞活化，金屬基質蛋白酶2(MMP-2)的表達和活性增加，并出現(xiàn)少突膠質細胞死亡和髓鞘堿性蛋白缺失。

2 永久性全腦缺血模型

永久性全腦缺血模型是通過永久性結扎相應腦血管而制備的全腦缺血模型，根據(jù)操作方法分為4-VO、3-VO、2-VO和雙側頸總動脈狹窄模型等。其中2-VO是研究VD的較好動物模型。永久性全腦缺血模型的缺點是全腦缺血模型影響全身其他器官的功能，與由單一腦動脈閉塞所致的VD亞型不同。

2.1 4-VO Pulsinelli 等[5]通過阻斷雙側頸總動脈及椎動脈血流成功建立了四血管閉塞法大鼠全腦缺血模型。操作方法：頸前正中切口，分離雙側頸總動脈，將無損動脈夾輕放于雙側動脈周圍；同時枕部切口暴露第一頸椎翼小孔，電凝雙側椎動脈，造成永久性閉塞。24 h后夾閉雙側頸總動脈，造成明顯的腦缺血。Pulsinelli等四血管法大鼠全腦缺血模型被廣泛采用,但也存在著易出血、椎動脈不易阻斷、操作中呼吸抑制等缺點。為提高模型的可靠性，許多學者對Pulsinelli等四血管法模型做了改良。Barros等[6]通過先結扎雙側椎動脈，間隔1周后再次結扎雙側頸內動脈，制備慢性腦低灌流的4-VO模型。在術后第40天，通過被動逃避實驗和Y迷宮檢測，16月齡大鼠表現(xiàn)為輕度學習功能受損；其中部分大鼠出現(xiàn)皮質神經(jīng)元缺血性壞死。

2.3 2-VO Farkas等[9]通過夾閉雙側頸總動脈，合并低血壓以減少腦血流量，造成急性腦缺血。嚙齒動物(沙土鼠除外)腦血液循環(huán)有豐富的側支循環(huán)，僅結扎雙側頸總動脈不足以明顯降低腦血流量，通過一些改良，如頸部軟組織加壓，或通過剪尾放血、腹腔注射硝普鈉和頸總靜脈處置管抽血等方法降低血壓，增加模型的可靠性。于術后第7天左右，通過Morris水迷宮試驗可觀察到學習和記憶功能受損，大約術后8周經(jīng)八臂迷宮實驗也可檢測到空間工作記憶受損。2-VO模型動物認知功能的損害主要是由腦白質病變引起的，包括脫髓鞘、髓鞘堿性蛋白的缺失和小膠質細胞的活化等。一般從術后4周開始，海馬CA1區(qū)會出現(xiàn)星形膠質細胞密度增加和神經(jīng)元的缺失[9]。血管病變于術后12個月出現(xiàn)，表現(xiàn)為毛細血管壁的管壁增厚和纖維化[10]。

2.4 雙側頸總動脈狹窄模型 有研究者應用線圈縮窄雙側頸總動脈，制備沙土鼠永久性全腦缺血模型[11]。在術后6周，通過被動逃避實驗可觀察到模型動物的記憶損害。組織學檢查發(fā)現(xiàn)術后1周在海馬、基底節(jié)和大腦皮質存在局灶性神經(jīng)元缺失(直徑約1 mm)，并伴有膠質增生；在術后8周，出現(xiàn)彌漫性白質損害，其特征為白質稀疏，不伴有局部缺血改變的膠質增生，髓鞘堿性蛋白和軸索纖維減少。Nishio等[12]使用彈簧圈縮窄小鼠的雙側頸總動脈，造成永久性腦低灌注。由于該小鼠額葉-皮質下環(huán)路受損，不伴有明顯的灰質改變，表現(xiàn)為工作記憶障礙，類似于皮質下VD。參考記憶和工作記憶的損害出現(xiàn)于術后5～6個月。在術后8個月，組織學分析可見海馬萎縮，有細胞皺縮和凋亡。Miki等[13]選擇C57BL/6小鼠外置彈簧圈制備雙側頸總動脈狹窄模型，在輕度腦低灌注組(腦血流量降低至術前的30%～50%)，小鼠表現(xiàn)為快速移動行為和空間參考記憶障礙。在術后5周，組織學分析可見腦白質疏松，并有小壞死灶，伴隨反應性星形膠質細胞增生、小膠質細胞浸潤、軸突缺失和髓鞘崩解，在左側大腦半球病變更為明顯。

3 局灶性腦缺血模型

局灶性腦缺血模型模擬了人類永久性腦梗死的病理生理過程，梗死灶固定，重復性好，對于VD的研究具有重要意義。其缺點是該模型在梗死部位、梗死體積和病變嚴重程度等方面均與人類腦卒中存在差異，且動物術后可能出現(xiàn)嚴重偏癱癥狀，從而影響行為學的檢測。

3.1 線栓法 1986年Koizumi等首次報道了不用開顱的大鼠大腦中動脈可逆性阻斷模型的制備方法，即大腦中動脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)。操作方法：分離一側頸總動脈，由頸外動脈殘端插入一頂端粘有硅橡膠的尼龍單絲線，至頸內動脈顱內分叉部時可阻斷流入大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)的血流。1989年Zea-Longa等以頂端燙成光滑圓球的4-0尼龍單絲線，由頸總動脈分叉處切口導入，也制成相似的模型。在大鼠和小鼠，單側的MCAO模型可以產(chǎn)生局灶性缺血灶，受累區(qū)域包括皮質、尾狀核和皮質下白質，引起對側的運動感覺功能障礙。Roof等[14]發(fā)現(xiàn)在永久性大鼠MCAO模型，當阻塞部位在MCA近端時，損害紋狀體和皮質，表現(xiàn)為學習和記憶功能受累，定位航行實驗異常，肢體放置反應和姿勢反射均受累。MCA遠端阻塞的大鼠，僅導致皮質損害，出現(xiàn)運動感覺功能障礙，2周后基本恢復，定位航行實驗正常。小鼠MCAO模型表現(xiàn)出的認知功能改變差異很大，主要是與性別、種屬和缺血的持續(xù)時間有關。Bou?t等[15]利用瑞士小鼠制備MCAO模型(短暫性缺血30 min)，發(fā)現(xiàn)小鼠在術后1個月存在運動感覺功能障礙，Morris水迷宮實驗檢測正常，但是被動逃避實驗表現(xiàn)出學習能力障礙，主要是由于皮質和紋狀體受累導致。

3.2 內皮素注射法 腦內立體定向注射內皮素-1，利用其血管收縮作用，可逆性阻斷MCA的血流，誘發(fā)短暫性、局灶性腦缺血，形成局灶性腦梗死。單側紋狀體注射內皮素的動物，在2周時出現(xiàn)前肢不對稱和運動功能受損[16]。目前對該模型還沒有認知功能檢測的數(shù)據(jù)。

3.3 栓塞法 采用<200 μm的同種大鼠(家兔或猴)血凝塊栓子懸液，由頸外動脈注入栓子后將頸外動脈結扎，開放頸總動脈，使栓子自頸內動脈進入顱內的各動脈，造成多處小梗死灶(直徑約1 mm)或較大的區(qū)域性梗死。栓子來源也可以是懸浮的膽固醇結晶、塑料微粒或瓊脂糖微粒等。實驗動物主要表現(xiàn)為學習能力受損[17]。

通過血管內注射光化學誘導劑，然后用特定冷光源照射頭顱局部，激發(fā)光化學反應，使血管內皮細胞破壞，血管內血栓形成，進而形成血栓-栓塞過程，導致腦梗死。術后第2天，通過Morris水迷宮實驗可觀察到學習能力受損，經(jīng)過大約5周時間可能恢復正常。病變主要在大腦皮質，也可累及海馬、基底節(jié)和皮質下白質[18]。

3.4 高血壓病動物模型 自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat)是具有持久性血壓升高的大鼠品系，自發(fā)性高血壓腦卒中傾向大鼠(stroke-prone spontaneously hypertensive rat)是其中一個重要亞系。在自發(fā)性高血壓腦卒中傾向大鼠亞系中，隨鼠齡增加血壓逐漸升高，并且出現(xiàn)腦萎縮、神經(jīng)元缺失和膠質增生，與人類高血壓所導致的腦損害類似。在自發(fā)性高血壓大鼠的大腦皮質和基底節(jié)區(qū)，還能夠觀察到大小不等的出血病灶。自發(fā)性高血壓大鼠伴有膽堿能系統(tǒng)傳遞功能障礙，還表現(xiàn)為多巴胺能神經(jīng)元功能減低和去甲腎上腺素能功能亢進，類似于注意缺陷-多動障礙的疾病特征。通過被動逃避實驗和Y迷宮檢測，發(fā)現(xiàn)該模型鼠存在學習和記憶功能障礙[19]。

通過外科手術縮窄胸主動脈制備獼猴慢性高血壓模型[20]。在術后12個月，獼猴開始出現(xiàn)認知功能減退，表現(xiàn)為短期記憶損害，注意力和執(zhí)行功能障礙。認知功能障礙的嚴重程度與收縮壓和舒張壓的水平相關。腦內病變主要是形狀不規(guī)則的小梗死灶(直徑<500 μm)，伴有膠質增生，病灶散在于大腦皮質的灰質和白質、腦干和小腦，在前腦的白質區(qū)尤為明顯。

4 腦小血管病(cerebral small vessel diseases，CSVD)的動物模型

CSVD發(fā)病率日益增加，約占腦卒中的25%。其臨床表現(xiàn)主要是卒中(深部小梗死、腦出血)，認知和情感障礙，錐體外系癥狀、步態(tài)和排尿異常等，是導致VCI/VD的主要原因之一。為了研究高同型半胱氨酸[21]、Notch3基因突變[22]、M5R基因突變、糖尿病、腦淀粉樣血管病和老齡(如大鼠鼠齡≥12個月)等單一因素對腦血管結構和功能的影響，以及在CSVD發(fā)病機制中的作用，研究者們復制了相應的各類動物模型，如高同型半胱氨酸血癥模型、CADASIL模型(Notch3轉基因鼠)、M5R-/-轉基因鼠、糖尿病大鼠和小鼠、腦淀粉樣血管病動物模型和衰老動物模型等，模擬了這些致病因素對人類疾病的影響。雖然沒有一種模型可以涵蓋人類CSVD的所有特征，但可以根據(jù)研究的內容合理選擇有效的動物模型，為深入研究CSVD提供了可行的方法。

總之，選擇合適的動物模型是進行醫(yī)學研究的前提，由于臨床研究的種種限制，動物模型已成為研究VD發(fā)病機制、病理學改變、認知功能損害特點和防治措施等的有效工具。VCI概念的范疇包括了VCIND、VD和混合型癡呆，目前還沒有一種最適宜的VCI動物模型。從前述內容可見，制備方法不同的VD動物模型，病理組織學改變和認知功能損害程度也有所不同，研究者應該針對VCI的亞型和研究目標做出相應的選擇。

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(本文編輯：鄒晨雙)

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.01.016

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12521255)

150001 哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內科

張艷，Email：zhangyanhyd@hotmail.com

R743.3

A

1006-2963 (2015)01-0067-04

2014-04-15)