任宇鵬，宋純，孟慶凱

（遼寧省腫瘤醫(yī)院大腸外科，沈陽110042）

Tspan8在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及小干擾RNA干擾后對SW620細(xì)胞功能的影響

任宇鵬，宋純，孟慶凱

（遼寧省腫瘤醫(yī)院大腸外科，沈陽110042）

目的 檢測Tspan8在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，采用siTspan8下調(diào)Tspan8的表達(dá)，觀察其對SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)移、浸潤及增殖功能的影響。方法采用Western blot和實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測4種結(jié)腸癌細(xì)胞系中Tspan8蛋白和mRNA表達(dá)水平，以siTspan8對SW620細(xì)胞中Tspan8進(jìn)行干擾，干擾后采用MTT及Transwell對增殖、轉(zhuǎn)移及浸潤進(jìn)行檢測。結(jié)果4種結(jié)腸癌細(xì)胞系中Tspan8在蛋白水平及mRNA水平均有表達(dá)，Western blot顯示來自轉(zhuǎn)移灶的人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620中Tspa8表達(dá)水平高于來自原發(fā)灶的Colo-205、HCT-116及HT-29，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），qRT-PCR顯示SW620中Tspan8mRNA表達(dá)高于Colo-205、HCT-116及HT-29，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。MTT及Transwell顯示siTspan8對SW620中Tspan8進(jìn)行干擾后，結(jié)腸癌細(xì)胞增殖沒有改變，轉(zhuǎn)移及浸潤能力減弱。結(jié)論Tspan8在結(jié)腸癌細(xì)胞中有表達(dá)，下調(diào)Tspan8表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及浸潤有抑制作用。

結(jié)腸癌；Tspan8；小干擾RNA；四跨膜蛋白

結(jié)腸癌是發(fā)病率較高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，呈年輕化及發(fā)病率逐年增高趨勢，轉(zhuǎn)移及浸潤是結(jié)腸癌惡性行為的主要特征之一，首要轉(zhuǎn)移臟器以肝臟為多，一半患者可能最終出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，約25%的結(jié)腸癌患者首診時發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。伴有轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者生存時間低于1年，因此其轉(zhuǎn)移特征一直是研究的主要方向［1］。四跨膜蛋白超家族在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及浸潤中的作用受到研究者關(guān)注［2］，Tspan8是研究較深入的四跨膜蛋白超家族（transmembrane 4 superfamily，TM4SF）成員，在胃癌、肝癌及食管癌中高表達(dá)，與腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)呈正相關(guān)［3］。Tspan8可能在腫瘤的預(yù)測、診斷、預(yù)后評估方面具有重要的臨床意義［4］。

本研究對結(jié)腸癌細(xì)胞株中Tspan8在蛋白及mRNA水平的表達(dá)進(jìn)行了檢測，并采用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術(shù)對其表達(dá)進(jìn)行下調(diào)，從而進(jìn)一步研究其在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo-205、HCT-116、SW620及HT-29購自中國中科院上海細(xì)胞庫，采用常規(guī)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)、傳代及保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

兔多克隆Tspan8抗體及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Biorbyt公司，膜蛋白提取試劑盒購自百仕葆北京生物醫(yī)藥科技有限公司，All-in-One qPCR Mix試劑盒購自美國GeneCopoeia公司，Lipofectamine LTX and PLUS購自美國Invitrogen公司。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成。siTspan8及siControl均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 Western blot法：按說明書提取結(jié)腸癌各細(xì)胞株總蛋白，BCA定量試劑盒測定蛋白的濃度，樣品均定量為5 g/L，每條泳道均上樣60 μg蛋白，經(jīng)12%十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓70 V條件下經(jīng)80 min電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗，4℃孵育過夜。TBST洗膜，加二抗室溫孵育1.5 h，TBST清洗后ECL發(fā)光，凝膠顯像儀顯像。

1.3.2 實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）法：采用RNA分離試劑盒Trizol試劑盒提取純化各細(xì)胞株總RNA；所有RNA樣本濃度均稀釋至1 g/L，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄—擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。RTPCR反應(yīng)體系（2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，50× Syber Green 2 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 4 μL）。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸10 s，40個循環(huán)。所有反應(yīng)均設(shè)立了復(fù)孔，并以DEPC水代替模板，cDNA為陰性對照。Tspan8上游引物：5′-CAGTAGCATATGCGTGTCA-3′，下游引物：5′-CCAGCTGGGCTGAGACTA-3′；GAPDH上游引物：5′-GCATCGCCAAGGCTCAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGCAGACGTCAGTCGA-3′。

1.3.3 siTspan8轉(zhuǎn)染：siTspan8序列為5′-CAACCUA CUUCAAUGTT-3′。將（3.0～8.0）×105細(xì)胞接種于6孔板，選擇24 h內(nèi)細(xì)胞融合達(dá)到70%～90%的細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)Lipofectamine LTX and PLUS試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用Western blot和qRT-PCR對 siTspan8組和siNegative組中的Tspan8表達(dá)進(jìn)行比較，進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率的檢測。

1.3.4 細(xì)胞增殖檢測：采用MTT檢測細(xì)胞增殖，按MTT試劑盒操作，比色選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，重復(fù)3次。

1.3.5 細(xì)胞遷移能力檢測：按Transwell Polycarbonate Membrane Inserts試劑盒操作步驟進(jìn)行操作，在顯微鏡下取8個不同視野（×100）進(jìn)行計數(shù)，重復(fù)3次，計算每次遷移細(xì)胞減少的百分比。

1.3.6 細(xì)胞侵襲能力檢測：按BioCoat Matrigel invasion chamber試劑盒操作步驟進(jìn)行操作，顯微鏡下取8個不同視野（×100）進(jìn)行計數(shù)，重復(fù)3次，計算侵襲細(xì)胞減少百分比。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用PASW Statistics 18.0軟件進(jìn)行作圖及統(tǒng)計分析，計量資料采用x±s表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。Western blot法采用QuantityOne檢測灰度值，與qRT-PCR結(jié)果均采用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行單因素方差分析及作圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌細(xì)胞株的Western blot檢測結(jié)果

在26 kDa處有灰色條帶顯示，Tspan8在4組細(xì)胞株中均有表達(dá)，來自結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶的SW620中Tspan8蛋白表達(dá)較來自原發(fā)灶的Colo-205、HCT-116及HT-29中高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1A。

2.2 結(jié)腸癌細(xì)胞株的qRT-PCR檢測

4組細(xì)胞株中Tspan8在mRNA水平均有表達(dá)，SW620中Tspan8 mRNA表達(dá)與Colo-205、HCT-116及HT-29對比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1B。

2.3 Western blot和qRT-PCR對siTspan8轉(zhuǎn)染效果的檢測

Western blot顯示siTspan8轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞后，Tspan8表達(dá)條帶明顯淡于siControl及siTspan8，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。qRT-PCR顯示siTspan8轉(zhuǎn)染后，SW620細(xì)胞Tspan8 mRNA表達(dá)量明顯降低，沉默效率約為55%～66%，沉默效果佳，可進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖

MTT檢測siTspan8干擾后SW620細(xì)胞株的增殖能力，通過采集0、24、48、72、120 h時間點(diǎn)的數(shù)據(jù)，siControl、Tspan8與siTspan8比較結(jié)果顯示，siTspan8干擾對SW620細(xì)胞增殖能力的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

2.5 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力檢測

Transwell顯示，siTspan8轉(zhuǎn)染細(xì)胞與siControl轉(zhuǎn)染細(xì)胞及Tspan8細(xì)胞相比，明顯降低SW620細(xì)胞的遷移能力（P＜0.05），見圖3A。

2.6 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力檢測

瞬時轉(zhuǎn)染siTspan8較siControl及Tspan8組明顯降低SW620細(xì)胞的侵襲能力（P＜0.05），見圖3B。

3 討論

Western blot結(jié)果顯示，在蛋白水平Tspan8在結(jié)腸癌細(xì)胞株中均有表達(dá)，在來自轉(zhuǎn)移灶的SW620中表達(dá)量高于來自原發(fā)灶的細(xì)胞株，Tspan8過表達(dá)可能與消化系統(tǒng)腫瘤轉(zhuǎn)移及浸潤的惡性行為相關(guān)［5，6］。qRT-PCR檢測顯示，來自轉(zhuǎn)移灶的人胰腺腺癌細(xì)胞系的Tspan8 mRNA表達(dá)與來自原發(fā)灶的細(xì)胞系相比表達(dá)水平也較高，這與Western blot結(jié)果一致。有研究顯示，Integrinα3、β1明顯與CD9、CD81、CD151共位，Integrinα6β4與CD151及CO-29大部分共位，形成復(fù)合體，對結(jié)腸癌細(xì)胞運(yùn)動具有促進(jìn)作用［7］。Tspan8在肝癌及胃癌中過表達(dá)，與腫瘤臨床分期呈正相關(guān)，與腫瘤的生存率呈負(fù)相關(guān)［8］。目前還沒有Tspan8與結(jié)腸癌臨床病理的相關(guān)性研究。結(jié)腸癌患者死亡原因以復(fù)發(fā)、肝轉(zhuǎn)移、腹腔轉(zhuǎn)移及肺轉(zhuǎn)移為多，Tspan8可能與這些轉(zhuǎn)移灶復(fù)發(fā)灶的形成密切相關(guān)。Herlevsen等［9］研究認(rèn)為，大鼠D6.1A（Tspan8）與Integrinα6β4結(jié)合會增加惡性腫瘤細(xì)胞運(yùn)動性，對肝轉(zhuǎn)移灶形成有促進(jìn)作用。轉(zhuǎn)移可能因D6.1A/ Integrin β4β4形成共位復(fù)合體，從黏附支持因子轉(zhuǎn)為轉(zhuǎn)移支持因子，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及浸潤能力。有研究認(rèn)為，二甲雙胍對結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性行為可能有抑制作用，可能通過作用于細(xì)胞膜蛋白實(shí)現(xiàn)［10］。

本研究采用siRNA技術(shù)對SW620結(jié)腸癌細(xì)胞中Tspan8進(jìn)行了成功的轉(zhuǎn)染下調(diào)，干擾效率滿意，干擾后SW620細(xì)胞增殖能力沒有改變，轉(zhuǎn)移及浸潤能力下降。這說明，作為細(xì)胞膜蛋白，Tspan8對細(xì)胞的增殖能力沒有影響，Tspan8在惡性腫瘤細(xì)胞生長、分裂中不起到主要作用，Tspan8下調(diào)后結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及浸潤能力明顯下降，Tspan8可能參與結(jié)腸癌細(xì)胞的運(yùn)動，過表達(dá)會增加惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移活性，并增加其浸潤能力。

也有研究認(rèn)為，Tspan8可能啟動腫瘤新生血管形成［11］，并與Notch、c-Met、Rhokinase等信號通路具有相關(guān)性［12，13］，但需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。本研究提示，Tspan8可以作為膜蛋白標(biāo)志物，也可用于確定來源于不同細(xì)胞的間質(zhì)干細(xì)胞，是干細(xì)胞治療的可能策略之一［14］。Tspan8為靶向的siRNA，是治療結(jié)腸癌可能策略之一。對于四跨膜蛋白超家族的進(jìn)一步研究，具有更深遠(yuǎn)的意義。

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（編輯 陳 姜）

Expression of Tspan8 in Colon Cancer Cell Lines and Effects of siRNA-mediated Tspan8 Gene Silencing on the Cell Function of SW620

REN Yu-peng，SONG Chun，MENG Qing-kai
（Department of Colorectal Surgery，Liaoning Cancer Hospital and Institute，Shenyang 110042，China）

ObjectiveTo evaluate the expression of Tspan8 in colon cancer cell lines and investigate the effect of siTspan8 on the proliferation，invasion and migration of SW620 cells.MethodsWestern blot and quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）were used to detect the protein and mRNA expression in 4 different colon cancer cell lines.siTspan8 was use to knockdown the expression of Tspan8 in SW620 cell. MTT and Transwell assay were used to detect the proliferation，invasion and migration of siTspan8 interfered SW620 cells.ResultsTspan8 which detected by Western blot and qRT-PCR in all four colon cancer cell lines.Western blot and qRT-PCR showed that Tspan8 expressions were higher in SW620，which derived from metastasis colon cancer，than in Colo-205，HCT-116 and HT-29 cell lines，which derived from primary tumor.MTT and Transwell showed that the proliferation has not been changed，the invasion and migration were inhibited after Tspan8 was inferred with siTspan8.ConclusionTspan8 was expressed in colon cancer cells and downregulation of Tspan8 expression may inhibit the invasion and metastasis of colon cancer cells.

colon cancer；Tspan8；small interfering RNA；tetraspanin

R735.3

A

0258-4646（2015）01-0034-04

遼寧省自然科學(xué)基金（2014020102）

任宇鵬（1978-），男，主治醫(yī)師，博士. E-mail：pangheshangmomo@163.com

2014-10-13

網(wǎng)絡(luò)出版時間：