白宇，賴亞新，李靜，單忠艷

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽(yáng)110004）

PTU誘導(dǎo)大鼠低甲狀腺素血癥與胰島素抵抗相關(guān)

白宇1，2，賴亞新1，李靜1，單忠艷1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽(yáng)110004）

目的 探討低甲狀腺素血癥大鼠是否存在胰島素抵抗（IR）及其可能機(jī)制。方法將12只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照（NC）組及低甲狀腺素血癥（HypoT4）組。NC組正常喂養(yǎng)，HypoT4組給予丙硫氧嘧啶（PTU）水（濃度為3 ppm）喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周后，眶后采血測(cè)定促甲狀腺素（TSH）、總甲狀腺素（TT4），用高胰島素—正葡萄糖鉗夾技術(shù)評(píng)估2組大鼠的胰島素敏感性。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)大鼠血清胰島素水平，通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)脂肪細(xì)胞的瘦素（Ob）和脂聯(lián)素（APN）mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果HypoT4組大鼠的血清TSH水平與NC組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但TT4明顯低于NC組（P＜0.05），2組大鼠的基礎(chǔ)狀態(tài)血糖和穩(wěn)態(tài)血糖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；HypoT4組的基礎(chǔ)胰島素水平有下降趨勢(shì)，但較NC組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），鉗夾穩(wěn)態(tài)狀態(tài)下胰島素水平明顯高于NC組（P＜0.05）；HypoT4組的葡萄糖清除率和葡萄糖代謝率明顯低于NC組（P＜0.05），HypoT4組Ob mRNA表達(dá)水平低于NC組（P＜0.05），APN mRNA表達(dá)水平低于NC組，雖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有明顯下降趨勢(shì)（P= 0.07）。結(jié)論低甲狀腺素血癥大鼠存在胰島素抵抗，并可能與脂肪細(xì)胞分泌Ob及APN減少有關(guān)。

低甲狀腺素血癥；胰島素抵抗；丙硫氧嘧啶；瘦素；脂聯(lián)素

糖尿病和甲狀腺功能減退是常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，均嚴(yán)重威脅人類的健康，更是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。糖尿病與甲狀腺功能的相互作用也一直受到廣泛關(guān)注。甲狀腺激素調(diào)節(jié)基礎(chǔ)能量代謝并通過(guò)多種途徑影響糖脂代謝，臨床及亞臨床甲減患者常伴發(fā)糖尿病，而胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是2型糖尿病發(fā)生的基礎(chǔ)，已有研究證實(shí)甲狀腺功能減退與胰島素敏感性有關(guān)。然而對(duì)低甲狀腺素血癥與IR的關(guān)系的研究很少。本研究在建立低甲狀腺素血癥大鼠模型的基礎(chǔ)上，探討低甲狀腺素血癥狀態(tài)下是否存在IR，并通過(guò)檢測(cè)脂肪組織分泌的與胰島素敏感性關(guān)系密切的瘦素（leptin，Ob）和脂聯(lián)素（adiponectin，APN）mRNA的表達(dá)水平變化，初步探討低甲狀腺素血癥引起IR的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

8周齡SPF級(jí)SD大鼠12只，雌雄各半，體質(zhì)量200～257 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。將大鼠飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，飼養(yǎng)期間可自由飲水進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組，n=6）和低甲狀腺素血癥組（HypoT4組，n=6）。HypoT4組給予丙硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）水（濃度為3 ppm）喂養(yǎng)，其他條件與NC組相同。于第8周采血檢測(cè)甲狀腺功能并進(jìn)行高胰島素—正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)。

1.2 高胰島素—正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)

具體方法參考文獻(xiàn)［1］。給予大鼠10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔麻醉，分離左頸動(dòng)脈和右頸內(nèi)靜脈，分別插入PE-50導(dǎo)管，用大頭針?lè)忾]，并經(jīng)頸部皮下隧道延續(xù)至頸背，縫合皮膚。頸靜脈用于注入胰島素和葡萄糖，頸動(dòng)脈用于采血標(biāo)本。待大鼠度過(guò)應(yīng)激期后，于清醒狀態(tài)下進(jìn)行鉗夾試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前將大鼠禁食12 h。連接輸液泵、輸液管道及三通管等輸液裝置。首先，經(jīng)頸動(dòng)脈采血0.5 mL（0 min），測(cè)基礎(chǔ)血糖（basic blood glucose，BBG）?；A(chǔ)胰島素（basic insulin，BIns）（丹麥諾和諾德公司Novolin R，濃度0.08 U/mL）和30%葡萄糖注射液分別用數(shù)字式微量注射泵（SK-500Ⅲ型）進(jìn)行注射。胰島素以0.36 U·kg-1·h-1的恒定速度輸入，5 min后用羅氏快速血糖儀測(cè)量血糖。若此時(shí)血糖超過(guò)BBG± 0.5 mmol/L，則開始輸入30%葡萄糖。葡萄糖輸注率從4～6 mg·kg-1·min-1開始，以后每5 min測(cè)1次血糖，不斷調(diào)整葡萄糖輸入速率，使血糖保持在BBG±0.5 mmol/L范圍內(nèi)。60 min后，若連續(xù)3次測(cè)得血糖保持在上述范圍內(nèi)，可認(rèn)為達(dá)到穩(wěn)態(tài)。此時(shí)取動(dòng)脈血0.5 mL測(cè)血糖為穩(wěn)態(tài)血糖（homeostasis blood glucose，HBG），胰島素為穩(wěn)態(tài)胰島素（homeostasis insulin，HIns）。繼續(xù)上述過(guò)程，直到120 min結(jié)束，共采血24次。計(jì)算鉗夾實(shí)驗(yàn)60～120 min的平均葡萄糖代謝率（glucose metabolic rate，GMR）及葡萄糖清除率（glucose disposal rate，GDR），用于比較胰島素敏感性。

1.3 標(biāo)本留取及指標(biāo)檢測(cè)

動(dòng)物禁食12～14 h后取材，給予大鼠10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔麻醉，頸動(dòng)脈取血，血樣立即進(jìn)行低溫離心（3 000 r/min）10 min，分離血清置于-20°C凍存。取大鼠雙側(cè)附睪周圍脂肪組織立即置于液氮中進(jìn)行速凍，并轉(zhuǎn)移至-70°C凍存。

采用固相化學(xué)發(fā)光酶免疫法測(cè)定血清促甲狀腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）、總甲狀腺素（total thyroxine，TT4）（Immulite 1000，美國(guó)DPC公司）。大鼠血清胰島素水平測(cè)定均采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA），試劑盒購(gòu)自北京擎日生物科技有限公司。Real-time PCR檢測(cè)Ob和APN水平，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NC組和HypoT4組大鼠甲狀腺功能評(píng)估

HypoT4組大鼠的血清TSH水平與NC組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但TT4水平明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 HypoT4組大鼠和NC組IR的比較

HypoT4組與NC組大鼠的BIns和HIns無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；HypoT4組的BIns水平有下降趨勢(shì)，但較NC組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），鉗夾穩(wěn)態(tài)狀態(tài)下胰島素水平明顯高于NC組（P＜0.05）；GDR和GMR明顯低于NC組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 HypoT4組大鼠和NC組Ob和APN mRNA水平的比較

HypoT4組的Ob mRNA表達(dá)水平低于NC組（P＜0.05），APN mRNA表達(dá)水平低于NC組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.07）。見(jiàn)表3。

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是指由各種原因引起的長(zhǎng)期心輸出量減少、心臟收縮或舒張功能不全，是心血管疾病終末期的表現(xiàn)。隨著人口老齡化及心衰患者預(yù)期壽命增加，CHF已成為影響居民健康的高負(fù)擔(dān)疾病[1-3]。目前，對(duì)于CHF的治療，臨床上以防止和延緩心衰發(fā)展、降低患者死亡率為主要目的，而利尿劑是改善CHF患者癥狀的一線藥物[4]。然而，國(guó)外多項(xiàng)研究[5-6]指出，長(zhǎng)期或過(guò)量使用利尿劑可能導(dǎo)致低血鉀、低血鈉、利尿劑抵抗、利尿過(guò)度所致腎功能惡化和腎素血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活等，進(jìn)而加重病情，甚至導(dǎo)致患者死亡。

表2 NC組和HypoT4組大鼠血糖、胰島素、葡萄糖清除率、葡萄糖代謝率比較Tab.2 Values of BG，Ins，GDR and GMR in NC group and HypoT4group

BBG，basic blood glucose；HBG，homeostasis blood glucose；BIns，basic insulin；HIns，homeostasis insulin；GDR，glucose disposal rate；GMR，glucose metabolic rate.1）P＜0.05 vs NC group.

Group BBG（mmol·L-1）HBG（mmol·L-1）BIns（mU·L-1）HIns（mU·L-1）GDR（mg·kg-1·min-1）GMR（mg·kg-1·min-1）NC 6.62±0.79 6.72±0.90 0.36±0.09 3.77±0.87 40.38±15.18 37.76±18.33 HypoT47.15±0.98 7.11±0.86 0.25±0.12 5.71±1.181）19.17±8.081）13.97±6.171）

表3 NC組和HypoT4組大鼠Ob和APN mRNA水平比較（Tab.3 Levels of mRNA of Ob and APN in NC group and HypoT4group

1）P＜0.05 vs NC group.

Group Ob APN NC 0.31±0.05 5.12±2.13 HypoT40.15±0.081）2.65±1.85

3 討論

PTU是治療甲狀腺功能亢進(jìn)癥的常用藥物，其作用機(jī)理是抑制甲狀腺內(nèi)過(guò)氧化物酶活性，阻止甲狀腺內(nèi)酪氨酸碘化及碘化酪氨酸的縮合，從而抑制甲狀腺素的合成。同時(shí)，PTU可在外周組織中抑制T4轉(zhuǎn)變?yōu)門3，使得血清中活性較強(qiáng)的T3含量較快降低。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予大劑量PTU是常用的建立甲狀腺功能減退模型的方法，本研究通過(guò)給予小劑量PTU［2］（濃度為3 ppm）建立了大鼠低甲狀腺素血癥的模型。在給予該濃度PTU 13個(gè)月后，大鼠的甲功仍為低甲狀腺素狀態(tài)（本研究組另一個(gè)實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果），說(shuō)明低甲狀腺素模型穩(wěn)定。

目前，甲狀腺功能狀態(tài)對(duì)糖代謝的影響受到關(guān)注，且爭(zhēng)論不一。Alvirde-Garcia等［3］在對(duì)西班牙人進(jìn)行的關(guān)于亞臨床甲減與代謝綜合征及IR的橫斷面研究中發(fā)現(xiàn)，即使在正常范圍內(nèi)的低甲狀腺素水平也易出現(xiàn)血糖、胰島素及IR指數(shù)增高，且FT4與胰島素、IR指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。Owecki等［4］對(duì)22名有甲狀腺切除或放碘治療病史（不伴有糖尿病或者糖耐量異常）的甲減婦女的研究中，僅發(fā)現(xiàn)胰島素與FT4呈負(fù)相關(guān)。然而Chen等［5］在我國(guó)福建省對(duì)5 080人的流行病學(xué)調(diào)查分析中，發(fā)現(xiàn)IR和β細(xì)胞功能與TSH呈負(fù)相關(guān)，與FT4無(wú)關(guān)。本研究組前期流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果顯示正常范圍的TSH水平與胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model of assessment for insulin resistence index，HOMA-IR）無(wú)關(guān)［6］。本研究通過(guò)高胰島素—正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)證實(shí)低甲狀腺素血癥組大鼠在鉗夾穩(wěn)態(tài)狀態(tài)下胰島素水平明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05），且GDR及GMR明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。表明外周組織對(duì)葡萄糖的敏感性降低，低甲狀腺素狀態(tài)下已存在IR。該結(jié)果與西班牙學(xué)者Prats-Puig等［7］的研究結(jié)果相同，血清FT4與胰島素抵抗獨(dú)立相關(guān)。關(guān)于低甲狀腺素血癥引起IR的可能機(jī)制為：（1）T4調(diào)節(jié)脂肪組織分泌與IR相關(guān)的脂肪因子，從而影響外周組織對(duì)胰島素的利用；（2）在肌肉組織T4通過(guò)Ⅱ型脫碘酶轉(zhuǎn)化為T3，而Ⅱ型脫碘酶的活性下降導(dǎo)致肌肉細(xì)胞內(nèi)T3減少，使得葡萄糖感受器受損，進(jìn)而導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞功能紊亂，影響葡萄糖代謝［8，9］；（3）肌肉組織和脂肪細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（glucose transporter 4，GLUT4）轉(zhuǎn)錄和易位發(fā)生障礙導(dǎo)致胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)下降［8］；（4）甲狀腺功能輕度減退使基礎(chǔ)代謝率降低導(dǎo)致肥胖［10］。

脂肪組織不僅是儲(chǔ)存脂質(zhì)的倉(cāng)庫(kù)，還通過(guò)分泌脂肪因子行使復(fù)雜的代謝及內(nèi)分泌功能，Ob和APN是脂肪組織分泌的2個(gè)最重要的脂肪因子，調(diào)節(jié)糖代謝過(guò)程［11］。Ob能產(chǎn)生飽腹感，消耗能量。APN具有增強(qiáng)胰島素敏感性、抗炎癥過(guò)程、調(diào)節(jié)脂代謝等多種效應(yīng)。Ob可減少GLUT4的含量，在外周可抑制脂肪酸聚集；APN可刺激脂肪酸氧化，抑制糖異生。它們的共同作用方式是通過(guò)激活單磷酸腺苷活化蛋白激酶增加脂肪酸氧化，從而發(fā)揮代謝作用［12］，影響胰島素敏感性。目前關(guān)于甲狀腺功能與Ob和APN變化關(guān)系的研究較少且觀點(diǎn)不同，并大多集中在甲減及甲亢狀態(tài)下的血液中Ob和APN的變化。本研究發(fā)現(xiàn)給予8周PTU后，低甲狀腺素血癥組大鼠Ob mRNA表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，APN mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比也有下降趨勢(shì)，與Shahramian等［13］和Samira［14］的報(bào)道一致。提示在低甲狀腺素血癥狀態(tài)下產(chǎn)生的IR可能與Ob和APN的減少有關(guān)。

綜上所述，本研究成功建立了PTU誘導(dǎo)低甲狀腺素血癥大鼠模型，并進(jìn)一步驗(yàn)證了低甲狀腺素血癥時(shí)存在IR，其發(fā)生可能與Ob和APN的表達(dá)水平降低有關(guān)。因此，篩查甲狀腺素對(duì)及時(shí)發(fā)現(xiàn)IR的高危人群非常重要，并且也可據(jù)此對(duì)IR相關(guān)的疾病作出判斷。

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（編輯 王又冬）

PTU-induced Hypothyroxinemia Is Correlated with Insulin Resistance in Rats

BAI Yu1，2，LAI Ya-xin1，LI Jing1，SHAN Zhong-yan1
（1.Department of Endocrinology and Metabolism，Institute of Endocrinology，Liaoning Provincial Key Laboratory of Endocrine Disease，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Endocrinology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate whether the insulin resistance（IR）exists in the rats with propylthiouracil（PTU）-induced hypothyroxinemia and explore its possible mechanism.MethodsA total of 12 SD rats were randomly divided into two groups：normal control group（NC）and hypothyroxinemia group（HypoT4）.The NC group was normally fed，and the HypoT4group was fed with PTU water（3 ppm）.Eight weeks later，the blood samples of both groups were collected to measure the TSH and TT4.The hyperinsulinemic-euglycemic clamp technique was used to assess the insulin sensitivity and the serum insulin level was determined by ELISA method.Real-time PCR technology was used to measure the expression level of Leptin mRNA and Adiponectin mRNA in adipocytes.ResultsThere was no significant difference in TSH level between two groups（P＞0.05），but TT4 of the HypoT4group was obviously lower than that of NC group（P＜0.05）.No statistical difference was found between two groups about the basic blood glucose（BBG）and the homeostasis blood glucose（HBG）（P＞0.05）.No statistical difference was observed between two groups on the basic insulin（BIns）（P＞0.05），but the insulin level was tending downwards in the HypoT4group.Under the clamp steady state，the insulin level of the HypoT4group was obviously higher than the NC group（P＜0.05）.The glucose disposal rate（GDR）and the glucose metabolic rate（GMR）of the HypoT4group were lower than that of the NC group（P＜0.05）.The Leptin mRNA expression level of the HypoT4group was lower than the NC group（P＜0.05）.The Adiponectin mRNA expression level was lower than the NC group with a clear declining trend，however，there is no statistical difference（P=0.07）.ConclusionInsulin resistance exists in the rats with hypothyroxinemia，which is possibly relevant to the reduced excretion of Leptin and Adiponectin in adipocytes.

hypothyroxinemia；insulin resistance；propylthiouracil；leptin；adiponectin

R581.9

A

0258-4646（2015）01-0027-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81300645）

白宇（1986-），女，醫(yī)師，碩士.

單忠艷，E-mail：shanzhongyan@medmail.com.cn

：2014-09-18

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