崔守斌，姜英，武昕

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽110001；2.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東煙臺264100）

絲切蛋白1及前纖維蛋白1在外陰鱗狀細胞癌中的表達及意義

崔守斌1，2，姜英1，武昕1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽110001；2.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東煙臺264100）

目的 探究絲切蛋白1（CFL1）及前纖維蛋白1（PFN1）在外陰鱗狀細胞癌（VSCC）中的表達與意義。方法采用免疫組化和免疫印跡方法檢測CFL1及PFN1在VSCC中的表達及其與臨床病理資料相關(guān)性。結(jié)果CFL1在VSCC中的表達顯著高于外陰的正常皮膚（P＜0.05）；臨床Ⅲ期的表達明顯高于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.05）；在低分化、中分化的VSCC中的表達明顯高于高分化VSCC（P＜0.05）；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）。PFN1在VSCC中的表達顯著高于外陰的正常皮膚（P＜0.05）；臨床Ⅲ期的表達明顯高于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.05）；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）；VSCC低、中分化和高分化之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明：CFL1及PFN1在VSCC中的表達呈正相關(guān)（r2= 0.753，P＜0.001）。結(jié)論CFL1及PFN1的表達與VSCC的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。

絲切蛋白1；前纖維蛋白1；外陰鱗狀細胞癌；免疫組化；免疫印跡

外陰惡性腫瘤約90%以上為外陰鱗狀細胞癌（vulvar squamous cell carcinoma，VSCC），常見于60歲以上的絕經(jīng)后婦女，其5年生存率為58.9%～68.9%，目前病因尚不十分清楚。

絲切蛋白1（cofilin-l，CFL1）作為絲切蛋白的2個亞型之一，是一種分子量約為21 kDa的肌動蛋白結(jié)合蛋白（actin binding protein，ABP），基因存在于染色體11q13上，正常表達于真核生物多種非肌肉組織，尤其是腦和肝中高表達，在調(diào)控細胞運動方面起重要作用［1］，目前研究發(fā)現(xiàn)CFL1在肺癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌［2］中呈高表達，與腫瘤的生長、遷移、侵襲密切相關(guān)［3］。前纖維蛋白1（profilin-1，PFN1）也被稱為細胞骨架蛋白結(jié)合蛋白1，也是ABP的一種，作為前纖維蛋白家族的一個成員，分子量約為12～15 kDa，基因定位于17p13.3，于真核生物細胞中普遍存在，參與調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架重塑，細胞形態(tài)的維持、細胞黏附、運動、生長、分裂以及其配體依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)功能［4］。研究發(fā)現(xiàn)PFN1在一些癌中低表達，如乳腺癌、胰腺癌［5］、膀胱癌［6］、鼻咽癌、肝癌等，在另一些癌中高表達，如胃癌、腎癌［7］等。CFL1及PFN1在VSCC中表達如何，與VSCC發(fā)生發(fā)展是否有關(guān)尚不清楚。因此，本研究通過免疫組化法（SP法）和Western blot方法檢測CFL1及PFN1在VSCC中的表達情況，探討其與VSCC的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選自中國醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2003年6月至2013年6月35例住院VSCC患者；外陰整形手術(shù)中去除正常外陰皮膚組織的20例患者，選取的組織用10%的甲醛固定，制成石蠟塊。搜集VSCC患者的臨床病理資料：年齡32～75歲，平均年齡（55.9±3.6）歲。根據(jù)1988 FIGO臨床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期17例，Ⅲ期10例；分化程度：高分化19例，中分化10例，低分化6例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。

1.1.2 實驗試劑：小鼠抗人Cofilin-1單克隆抗體購自美國Proteintech公司，兔抗人單克隆Profilin-1抗體購自美國Abcam公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruze公司。SP試劑盒、DAB顯色試劑盒和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP）購自北京中山金橋公司，ECL試劑盒和BCA試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化方法檢測CFL1及PFN1蛋白的表達：石蠟切片常規(guī)脫蠟水化。3%H2O2常溫下孵育20 min，使內(nèi)源性過氧化物酶滅活，后行抗原修復(fù)，常溫下羊血清孵育30 min，Cofilin-1（1∶100）及Profilin-1（1∶400）于4℃冰箱過夜，生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG室溫孵育15 min，室溫下S-A/HRP中孵育15 min，后DAB顯色劑顯色，最后蘇木素復(fù)染封片。以PBS代替一抗作為陰性對照片。結(jié)果判定：CFL1及PFN1均為細胞質(zhì)和細胞核/細胞質(zhì)著色，陽性染色為黃色或棕黃色顆粒。使用生物圖片處理系統(tǒng)Meta Morph進行平均光密度值測算。每張切片平均光密度值的測算，選擇高倍鏡下5個不同視覺區(qū)域，每個區(qū)域包括正常皮膚的表皮和部分真皮、癌組織的癌巢與間質(zhì)，然后計算同一張切片的平均光密度值。

1.2.2 免疫印跡方法：取VSCC組織（10例）和正常外陰皮膚組織（10例），裂解液提取組織總蛋白，制好電泳凝膠后行SDS-PAGE電泳，蛋白電泳轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，其用5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，加入一抗［CFL1（1∶100）；PFN1（1∶400）；β-actin（1∶1 000）］4℃過夜，次日加二抗［山羊抗兔（1∶5 000）；山羊抗小鼠（1∶5 000）］，常溫孵育2 h，ECL試劑盒顯影。用β-actin作為內(nèi)參照物。用Quantity One軟件半定量分析特異性條帶的灰度值，與內(nèi)參照的灰度值的比較值作為蛋白的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CFL1在VSCC和外陰正常皮膚組織中的表達

CFL1陽性細胞表達于外陰正常表皮細胞全層，散在分布，呈細胞質(zhì)和細胞核陽性（圖1A），陽性細胞的平均光密度值0.284 9±0.011 6；VSCC癌巢細胞中有陽性表達，其間質(zhì)中也有表達（圖1B），陽性細胞的平均光密度值是0.341 0±0.012 0，2者有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.041）。

2.2 Profilin-1在VSCC和外陰正常皮膚組織中的表達

Profilin-1陽性細胞表達于外陰正常表皮近基底層和基底層，呈細胞質(zhì)和細胞核陽性（圖2A），陽性細胞的平均光密度值0.150 6±0.008 9，VSCC癌巢細胞中有陽性表達，其間質(zhì)中也有表達（圖2B），陽性細胞的平均光密度值是0.259 1±0.020 3，2者有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.028）。

2.3 CFL1與PFN1表達的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果表明：CFL1及PFN1在VSCC中的表達呈正相關(guān)（r2=0.753，P＜0.001），見圖3。

2.4 Western blot法檢測CFL1與PFN1的表達

正常外陰皮膚中CFL1的平均灰度值比值（0.33±0.09）低于VSCC（0.99±0.03），2者比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.000）。正常外陰皮膚中PFN1的平均灰度值比值（0.88±0.14）低于VSCC（1.39±0.16），2者比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.000），見圖4。

2.5 CFL1及PFN1的表達與VSCC的臨床病理特點的關(guān)系

2.5.1 CFL1蛋白表達的平均光密度值：VSCCⅢ期高于Ⅰ期與Ⅱ期，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中、低分化組高于高分化組，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，兩者有統(tǒng)計學(xué)上的差異（P＜0.05）；年齡＜45歲與≥45歲患者比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

2.5.2 PFN1蛋白表達的平均光密度值：VSCCⅢ期高于Ⅰ期與Ⅱ期（P＜0.05）；中、低分化組略高于高分化組，但兩者無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）；年齡＜45歲與≥45歲患者比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

3 討論

肌動蛋白結(jié)合蛋白作為一種調(diào)控肌動蛋白組裝和拆卸的蛋白質(zhì)，在肌動蛋白聚合與解聚的動態(tài)平衡中起了至關(guān)重要作用，它們有保持細胞形態(tài)、介導(dǎo)細胞遷移等生物學(xué)功能，且同癌細胞的轉(zhuǎn)移和浸潤緊密相關(guān)［8］。近年研究表明腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移與肌動蛋白結(jié)合蛋白介導(dǎo)的細胞骨架重組密切相關(guān)。肌動蛋白細胞骨架的組裝活躍是促進腫瘤細胞運動和遷移，誘發(fā)腫瘤發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移的重要因素。

CFLl是真核細胞內(nèi)的肌動蛋白結(jié)合蛋白中的一種，可改變肌動蛋白微絲結(jié)構(gòu)，是肌動蛋白細胞骨架重構(gòu)的重要調(diào)節(jié)因子。它的基本功能是連接纖維狀肌動蛋白微絲（F-actin），使F-actin解聚，同時中止單體球狀肌動蛋白微絲（G-actin）的匯集，進而增進了肌動蛋白的轉(zhuǎn)變，這種機制可能和細胞偽足形成有關(guān)。Ghosh等［3］通過實驗證明激活CFLl能誘導(dǎo)癌細胞的片狀偽足生成，且能引導(dǎo)細胞移動的趨勢，最終促進惡性細胞的遷移和侵襲。Yamaguchi等［9，10］通過實驗用siRNA沉默CFL1基因表達后，腫瘤細胞中CFLl表達下調(diào)，進而抑制腫瘤細胞偽足的裝配和穩(wěn)定性，最終阻止細胞運動和腫瘤的侵襲。Yap等［11］研究表明在人腦膠質(zhì)瘤的研究中CFLl水平和運動速率之間存在正相關(guān)，適量增加CFLl表達可以增加細胞的移行速度，而抑制CFLl的表達可降低癌細胞的遷移速率及侵襲性。同時，發(fā)現(xiàn)CFNl的過表達以濃度依賴的方式促進膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤細胞的運動，導(dǎo)致了腫瘤的侵襲，這些都提示CFNl的表達與腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。關(guān)于CFLl的活性調(diào)節(jié)，Polachini等發(fā)現(xiàn)CFLl活性主要受磷酸化/去磷酸化因素的調(diào)節(jié)，由于CFNl N末端絲氨酸-3（serine-3，Ser-3）位點的磷酸化，導(dǎo)致CFLl滅活，進而抑制其F-actin的解聚功能，當(dāng)這一位點再次去磷酸化后又可使CFLl對F-actin的解聚活性復(fù)活，此兩種形式的交替協(xié)調(diào)控制肌動蛋白的聚合和解聚，從而影響細胞的遷移，細胞收縮等［12，13］。目前這種現(xiàn)象在口腔癌及卵巢癌中均已發(fā)現(xiàn)，Polachini等［13］研究證實CFLl的表達下調(diào)抑制口腔癌細胞侵襲。Zhou等［14］研究證實CFLl的表達上調(diào)可促進腫瘤細胞的增殖和侵襲，導(dǎo)致卵巢癌的發(fā)展。在VSCC中，我們的研究發(fā)現(xiàn)CFNl高表達，且隨著細胞分化程度降低、臨床分期增高及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CFLl表達增加，進一步提示CFLl在VSCC中促進了腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，與VSCC的惡性進展呈正相關(guān)。

PFN1作為細胞微絲蛋白調(diào)節(jié)因子，在保持單體微絲蛋白和纖維狀微絲之間動態(tài)平衡上發(fā)揮關(guān)鍵作用，它通過結(jié)合肌動蛋白，調(diào)整細胞骨架的重構(gòu)，引發(fā)細胞運動。此外于細胞增殖和凋亡的過程中也起著重要的調(diào)節(jié)作用［15］。目前發(fā)現(xiàn)PFN1在一些腫瘤中低表達，如乳腺癌、胰腺癌。Zou等［16，17］研究表明PFN1可抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖，其機制為PFN1表達可上調(diào)PTEN基因，從而抑制AKT通路，繼而引起p27蛋白增加，然后p27和cyclin E/ Cdk2復(fù)合體相連結(jié)使細胞周期停滯在G1期，最終抑制細胞增殖。Yao等［5］研究證實在胰腺癌細胞中，PFN1通過SIRT3-HIF1α機制促進細胞凋亡。因此認為PFN1可能是一個腫瘤抑制因子。但PFN1在另一些腫瘤中高表達，Zou等［16］在乳腺癌細胞系中研究發(fā)現(xiàn)PFN1的過表達可誘導(dǎo)MDA-MB-231的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其機制是PFN1和肌動蛋白之間的相互作用誘導(dǎo)單體微絲蛋白和纖維狀微絲之間失衡，進而影響肌動蛋白聚合；同時PFN1的過表達也增加了R-鈣黏蛋白的表達，R-鈣黏蛋白也可促進MDA -231細胞向上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增進腫瘤細胞的遷移、侵襲［7］。我們的研究顯示PFN1在VSCC中高表達，且隨著臨床分期增高及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，PFN1表達增加，而與細胞分化程度無關(guān)，進一步提示PFN1在VSCC中可能具有促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用，增加腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的能力，而在細胞分化、增殖方面未起作用。

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（編輯 武玉欣）

Cofilin-1 and Profilin-1 Expression in Vulvar Squamous Cell Carcinoma and Its Clinical Significance

CUI Shou-bin1，2，JIANG Ying1，WU Xin1
（1.Department of Gynecology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，The Yantai Affiliated Hospital，Binzhou Medical College，Yantai264100，China）

ObjectiveTo investigate the expression of cofilin-1 and profilin-1 in vulvar squamous cell carcinoma（VSCC）and its significance.MethodsImmunohistochemic staining and Western blot were conducted to study the expression of cofilin-1 and profilin-1 in VSCC and its relationship with the clinicopathologic data.ResultsCofilin-1 expression was obviously higher in VSCC than in normal vulvar skins（P＜0.05）.Cofilin-1 expression was significantly higher in the FIGO Ⅲ stage than in the FIGO Ⅰ and Ⅱ stages（P＜0.05）.Cofilin-1 expression was obviously higher in those poorly and moderately differentiated VSCC than in those highly differentiated ones（P＜0.05）.Cofilin-1 expression was obviously higher in patients with lymph node metastasis than those without lymph node metastasis（P＜0.05）.Profilin-1 expression was obviously higher in VSCC than in normal vulvar skins（P＜0.05）.Profilin-1 expression was significantly higher in the FIGO Ⅲ stage than in the FIGO Ⅰ and Ⅱ stages（P＜0.05）.Profilin-1 expression was obviously higher in patients with lymph node metastasis than those without lymph node metastasis（P＜0.05）.Profilin-1 expression had no statistically significant differences between the poorly and moderately differentiated VSCC and the highly differentiated ones（P＞0.05）.The Pearson correlation analysis showed that cofilin-1 and profilin-1 expression was positively correlated in vulva squamous cell carcinoma（r2=0.753，P＜0.001）.ConclusionCofilin-1 and profilin-1 expression associates with the emergence and development of VSCC.

cofilin-1；profilin-1；vulvar squamous cell carcinoma；immunohistochemistry；Western blot

R737.35

A

0258-4646（2015）01-0010-05

國家自然科學(xué)基金（30973190）；沈陽市科學(xué)技術(shù)計劃項目（F11-264-1-39）

崔守斌（1982-），男，醫(yī)師，碩士.

武昕，E-mail：xinwu.1964@aliyun.com

2014-10-04

網(wǎng)絡(luò)出版時間：