■劉莉莉 程玉鵬 李慧玲 蔣倩倩 高 寧 丁常宏 國立東 楊炳友

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

乳脂肪是牛乳的主要營養(yǎng)成分，牛乳中的脂類物質(zhì)含量通常占4%[1]，其中甘油三酯是乳脂中最主要的脂類物質(zhì)，其次是甘油二酯、少量的磷脂、膽固醇及小部分的游離脂肪酸（FA）[2]。奶牛乳脂肪合成涉及多個(gè)代謝途徑，主要包括FA攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和活化，F(xiàn)A的內(nèi)源合成，F(xiàn)A去飽和作用，F(xiàn)A酯化，脂滴形成和分泌等過程，其中需要多種參與乳脂肪合成的關(guān)鍵酶和蛋白發(fā)揮作用。

研究發(fā)現(xiàn)FA可作為細(xì)胞中的信號(hào)分子，通過特定膜受體介導(dǎo)，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路從而發(fā)揮生物學(xué)作用[3]。FA本身可以調(diào)節(jié)脂肪的穩(wěn)衡狀態(tài)，而且可以調(diào)節(jié)生脂相關(guān)基因的表達(dá)[4]。FA也是乳腺組織攝取的一種重要營養(yǎng)素，其對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖具有一定的作用。有研究報(bào)道多種不同的短鏈FA和長(zhǎng)鏈FA能改變哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)脂肪酸從頭合成基因、甘油三酯合成基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因及其它生脂基因的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控乳脂肪的合成[5-6]。

然而，目前中鏈脂肪酸對(duì)奶牛乳腺乳脂肪合成的影響還不十分清楚，本試驗(yàn)對(duì)DCMECs添加飽和八碳脂肪酸辛酸（C8∶0），擬研究其對(duì)乳腺上皮細(xì)胞脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和活化相關(guān)蛋白CD36、FABP3、ACSL1和ACSS2 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)的影響，本試驗(yàn)為深入探討脂肪酸對(duì)乳脂肪合成的影響機(jī)理及為反芻動(dòng)物乳脂肪合成的營養(yǎng)調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

奶牛乳腺上皮細(xì)胞，辛酸鈉（Sigma），DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Sigma)，Trizol(Invitrogen)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR?Primx Ex TaqTM（TaKaRa），Prime ScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa），去除脂肪酸的牛血清白蛋白（Sigma），CD36 Antibody(Santa)，F(xiàn)ABP3 Antibody(Santa)，ACSL1 Antibody(Santa)，ACSS2 Antibody(Santa)。

1.2 DCMECs培養(yǎng)和處理

采用生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%FBS)于37℃，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)DCMECs。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乳腺上皮細(xì)胞等密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入無脂無血清培養(yǎng)基（DMEM/F12+1 g/l BSA）培養(yǎng)24 h，更換新鮮無脂無血清培養(yǎng)基并添加不同濃度的辛酸鈉，辛酸鈉的終濃度分別為0、0.5、1、2 mmol/l，每組3個(gè)平行，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞用于相關(guān)指標(biāo)的qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)。

1.3 引物設(shè)計(jì)

使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)各基因qRT-PCR的上游、下游引物（見表1）。

表1 基因的qRT-PCR引物序列

1.4 DCMECs總RNA提取、cDNA合成及各基因的qRT-PCR檢測(cè)

用Trizol試劑提取DCMECs總RNA。按照Prime ScriptTMRT reagent Kit說明書對(duì)RNA逆轉(zhuǎn)錄，使用SYBR?Primx Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行基因的qRT-PCR檢測(cè)。每個(gè)基因進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。各基因的qRTPCR結(jié)果采用2-ΔΔCT相對(duì)定量的方法（β-actin基因?yàn)閰⒄栈颍┯?jì)算目的基因的mRNA表達(dá)豐度[7]。

1.5 乳腺上皮細(xì)胞總蛋白提取

用2×SDS上樣緩沖液提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，收集并于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 Western Blotting檢測(cè)

配制濃縮膠和分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析，電泳結(jié)束后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，對(duì)膜進(jìn)行脫脂牛奶封閉，一抗、二抗孵育，發(fā)光液顯色，暗室中曝光、顯影。采用Band Scan 5.0軟件對(duì)Western blotting圖譜進(jìn)行灰度掃描，X光膠片上蛋白條帶經(jīng)掃描和Bandscan軟件讀取密度值后，與由同一轉(zhuǎn)移膜所測(cè)得的β-Actin蛋白比較得出蛋白的相對(duì)含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 辛酸鈉對(duì)CD36、FABP3、ACSL1和ACSS2基因表達(dá)的影響

采用 qRT-PCR 檢測(cè)DCMECs的CD36、FABP3、ACSL1和ACSS2各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖1～圖4所示。與未添加辛酸鈉的乳腺上皮細(xì)胞相比，0.5～2 mmol/l的辛酸鈉對(duì)細(xì)胞CD36和ACSL1基因的表達(dá)無顯著性影響（P>0.05），但0.5～2 mmol/l的辛酸鈉以濃度依賴的方式降低或顯著降低細(xì)胞FABP3和ACSS2基因的表達(dá)（P<0.05）。

2.2 辛酸鈉對(duì)CD36、FABP3、ACSL1和ACSS2蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot檢測(cè)DCMECs的CD36、FABP3、ACSL1和ACSS2各蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖5～圖9所示。

圖1 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞CD36基因表達(dá)的影響

圖2 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞FABP3基因表達(dá)的影響

圖3 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞ACSL1基因表達(dá)的影響

圖4 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞ACSS2基因表達(dá)的影響

圖5 辛酸鈉處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞CD36、FABP3、ACSL1和ACSS2蛋白表達(dá)的Western blotting結(jié)果

圖6 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞CD36蛋白表達(dá)的影響

圖7 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞FABP3蛋白表達(dá)的影響

圖8 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞ACSL1蛋白表達(dá)的影響

與未添加辛酸鈉的乳腺上皮細(xì)胞相比，0.5～2 mmol/l辛酸鈉對(duì)細(xì)胞CD36和ACSL1蛋白的表達(dá)無顯著性影響（P>0.05），但0.5～2 mmol/l辛酸鈉以濃度依賴的方式降低或顯著降低細(xì)胞FABP3和ACSS2的蛋白表達(dá)（P<0.05）。

3 討論

圖9 辛酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞ACSS2蛋白表達(dá)的影響

乳脂肪中的甘油三酯是以3個(gè)FA酯化到甘油-3-磷酸骨架的形式存在。乳脂肪合成需要的FA主要有兩個(gè)來源：乳腺上皮細(xì)胞中從頭合成FA及從飲食或者動(dòng)員體脂獲得FA[8]。反芻動(dòng)物從血液攝取的用于乳脂肪合成的長(zhǎng)鏈FA主要來自飲食和從消化道吸收的微生物FA，而乳脂肪中不到10%的FA來自于體脂動(dòng)員。有證據(jù)表明長(zhǎng)鏈脂肪酸的膜運(yùn)輸是一個(gè)促進(jìn)過程[9]。分化抗原簇36（CD36）和脂肪酸結(jié)合蛋白3（FABP3）在FA的攝取和運(yùn)輸中發(fā)揮作用。CD36是一種乳脂球膜蛋白，是長(zhǎng)鏈FA的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[10]，CD36在攝取FA進(jìn)入奶牛乳腺細(xì)胞時(shí)起到非常重要的作用[11]。FABP3是細(xì)胞內(nèi)脂結(jié)合蛋白家族，主要參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的運(yùn)輸，可將脂肪酸從細(xì)胞膜上運(yùn)送到甘油三酯和磷脂合成位點(diǎn)[12]。Acyl-CoA合成酶長(zhǎng)鏈家族成員1（ACSL1）和Acyl-CoA合成酶短鏈家族成員2（ACSS2）分別能活化細(xì)胞內(nèi)LCFA和SCFA，以激活進(jìn)入乳腺上皮細(xì)胞的脂肪酸，用于甘油三酯合成[13]。

研究發(fā)現(xiàn)短鏈FA和長(zhǎng)鏈FA能影響乳腺上皮細(xì)胞中脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪酸活化相關(guān)蛋白基因的表達(dá)。一定濃度的乙酸鈉能下調(diào)DCMECs的CD36 mRNA水平，上調(diào)FABP3 mRNA水平[14]。飽和LCFA會(huì)增加DCMECs中FABP3的mRNA豐度，不飽和LCFA一般會(huì)降低FABP3的mRNA豐度，而且一定濃度的軟脂酸能使DCMECs的CD36的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高[15]。100 μmol/l的十八碳脂肪酸能明顯促進(jìn)DCMECs的ACSL1的mRNA表達(dá)[16]。0.625～5 mol/l亞麻酸極顯著上調(diào)CD36基因的表達(dá)，而較高濃度亞麻酸能下調(diào)ACSL1和FABP3基因的表達(dá)[17]。有研究報(bào)道，辛酸鹽能影響小鼠脂肪細(xì)胞（3T3-L1）和人脂肪細(xì)胞甘油三酯的合成及相關(guān)生脂基因的表達(dá)[18-19]。本課題組前期研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)辛酸鹽能抑制DCMECs甘油三酯合成，并對(duì)脂肪酸合成關(guān)鍵酶和硬脂酰輔酶A去飽和酶、甘油三酯合成關(guān)鍵酶等的表達(dá)具有抑制作用[20-22]。然而，辛酸鹽對(duì)DCMECs脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪酸活化相關(guān)蛋白的表達(dá)還不清楚。

本研究檢測(cè)了不同濃度辛酸鈉處理的DCMECs中參與脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪酸活化相關(guān)蛋白CD36、FABP3、ACSL1和ACSS2的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的變化。結(jié)果表明，添加0.5～2 mmol/l的辛酸鈉對(duì)細(xì)胞CD36和ACSL1的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)無顯著影響，但0.5～2 mmol/l的辛酸鈉能以濃度依賴的方式降低或者顯著降低細(xì)胞FABP3和ACSS2的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)。說明辛酸鹽能負(fù)向調(diào)控DCMECs中脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和短鏈脂酰輔酶A合成酶的表達(dá)，從而抑制脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)及短鏈脂肪酸的活化，進(jìn)而影響DCMECs乳脂肪的合成。這與前人用辛酸鹽對(duì)其他細(xì)胞脂肪合成影響的研究基本一致。本試驗(yàn)為研究FA對(duì)乳脂肪合成調(diào)控提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為反芻動(dòng)物乳脂肪的營養(yǎng)調(diào)控提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究表明，辛酸鈉0.5～2 mmol/l對(duì)細(xì)胞CD36和ACSL1的表達(dá)無顯著影響；但0.5～2 mmol/l的辛酸鈉能以濃度依賴方式抑制FABP3和ACSS2的表達(dá)，證明辛酸對(duì)DCMECs乳脂肪合成具有一定的調(diào)節(jié)作用。