■遲淑艷 譚北平 楊奇慧 董曉慧 劉泓宇 章 雙

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江 524088）

晶體氨基酸（CAA）用于商業(yè)飼料中滿足動(dòng)物必需氨基酸的需要已經(jīng)有40多年的歷史[1]，不僅滿足機(jī)體蛋白質(zhì)的合成和生長(zhǎng)，還決定飼料的可接受性[2]。然而有研究表明，魚類對(duì)CAA和蛋白來源的氨基酸(PAA)在吸收速度上存在差異，前者在腸道的吸收快于后者而影響了體內(nèi)氨基酸的平衡，更多的氨基酸被分解而不是參與蛋白質(zhì)沉積，因而弱化了CAA的利用效果[3-6]。微膠囊氨基酸具備緩釋作用可以延緩蛋氨酸在腸道中的釋放，對(duì)CAA的吸收有改善作用。同時(shí)，通過投飼頻率干預(yù)可以調(diào)控機(jī)體內(nèi)游離氨基酸所出現(xiàn)的這種不平衡。Batterham發(fā)現(xiàn)豬可以通過改變投飼頻率（1～6次/d）改善CAA在消化道中出現(xiàn)峰值的時(shí)間，與PAA達(dá)到同步吸收，從而更有效地利用外源賴氨酸滿足生長(zhǎng)[7]。本試驗(yàn)擬通過投飼頻率干預(yù)，研究投喂次數(shù)的增加是否可以改善軍曹魚（Rachycentrron canadum Linnaeus）幼魚對(duì)外源蛋氨酸的利用效果。

1.材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

配制等氮、等脂的基礎(chǔ)飼料（見表1），分別添加晶體蛋氨酸（MET）和微膠囊蛋氨酸(采用樹脂包被蛋氨酸，RES)。所有原料經(jīng)粉碎后過60目篩，按表1飼料配方混合均勻，經(jīng)雙螺桿制粒機(jī)[F-26(Ⅱ)，華南理工大學(xué)科技實(shí)業(yè)總廠]擠壓成直徑2 mm的柱狀，在60℃恒溫下干燥1 h，陰干后破碎，置-20℃冰箱備用。

1.2 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在廣東恒興集團(tuán)國家“863”計(jì)劃海水養(yǎng)殖種子工程南方基地進(jìn)行。試驗(yàn)用軍曹魚魚苗經(jīng)商業(yè)飼料（臺(tái)灣全興飼料）馴化兩周后進(jìn)行分組。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)20尾魚[初始重(5.40±0.07)g]于500 L玻璃鋼養(yǎng)殖桶中。養(yǎng)殖期間，24 h供氧，鹽度30～34 g/l，溶解氧8～8.5 mg/l，水溫29～31 ℃，pH值7.8～8.0，養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)30 d。投飼頻率分別為2、3、4和5次（見表2），每個(gè)處理攝食率保持一致。

1.3 樣品收集及化學(xué)分析

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，禁飼24 h，對(duì)每個(gè)重復(fù)的魚進(jìn)行稱重，隨機(jī)選取3尾測(cè)定體長(zhǎng)、體重后放入-20℃冰箱保存供測(cè)體成分；隨機(jī)選取5尾取胃、肝臟和腸道，放入-80℃冰箱保存供測(cè)酶活性。試驗(yàn)飼料、全魚常規(guī)成分分析參考AOAC方法[8]。其中，水分的測(cè)定為105℃烘干恒重法；粗蛋白的測(cè)定為凱氏定氮法（N×6.25，F(xiàn)OSS Kjeltec System 2300，Sweden），脂肪的測(cè)定為索氏抽提法（Extraction System B-811，BüCHI Labortechnik AG，Switzerland）；粗灰分的測(cè)定為箱式電阻爐550℃灼燒法。

表1 飼料配方

表2 投飼頻率和投喂時(shí)間

取樣胃、肝和腸，預(yù)冷的雙蒸水沖洗干凈后，用預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH值7.8）10 000×g離心，取上清液制成1%的勻漿，測(cè)定胃蛋白酶（Pepsin）、胰蛋白酶(Trypsin)、總蛋白酶(T-protease)和淀粉酶(Amylase)。

胰蛋白酶活性測(cè)定[9]：將N-苯甲酰-L-Arg乙酯（BAEE）溶于含有氯化鈣的 Tris-Hcl（pH值7.6）緩沖液中，25℃水浴下進(jìn)行反應(yīng)，立即混合，253 nm波長(zhǎng)讀取吸光度，每隔1 min讀取吸光度，連續(xù)5 min，直至每分鐘吸光度增大值達(dá)恒定為止。活力單位定義為以BAEE為底物，反應(yīng)液pH值7.6，25℃，反應(yīng)體積3.0 ml，光徑1 cm的條件下，測(cè)定△A253nm，每分鐘使△A253nm增加0.001，反應(yīng)液中所增加的酶量為一個(gè)BAEE單位。胰蛋白酶酶活力計(jì)算：

式中：△A253nm——每分鐘內(nèi)253 nm處吸光度增大值(=△A樣/分-△A空/分)；

0.001——一個(gè)酶單位每分鐘吸光度增大0.001；

0.2 ml——酶液體積。

淀粉酶活性測(cè)定[10]：以可溶性淀粉為底物，采用碘-淀粉法，在660 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，活力單位定義為100 ml血清中的淀粉酶，在37℃，15 min水解5 mg淀粉為1個(gè)單位。

肝臟總蛋白酶(T-protease)活性測(cè)定[11]：以偶氮酪蛋白（azozasein）為底物，10 μl酶液加入含有1.5%偶氮酪蛋白的50 mM Tris-HCl緩沖液（pH值7.5），25℃下反應(yīng)10 min，加入0.5 ml 20%三氯乙酸終止反應(yīng)，混合物在6 500×g離心5 min，上清液在366 nm下測(cè)吸光度。

比活力（U/mg·pro）=酶活力/蛋白含量（mg/ml），組織蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[12]。

1.4 生產(chǎn)性能指標(biāo)計(jì)算

增重率(WG，%)=（Wt-W0）/W0×100；

特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)=(lnWt-lnW0)/d×100；

蛋白質(zhì)效率(PER，%)=（Wt-W0）/(Wi×Pf)×100；

飼料系數(shù)(FCR)=Wi/(Wt-W0)；

肥滿度(CF，g/cm3)=Wb/L3；

肝體比(hepatosomatic indexs，HIS)=Wl/Wb×100。

式中：Wt——終末體重（g）；

W0——初始體重（g）；

Pf——飼料粗蛋白含量（%）；

Wi——攝食飼料干重（g）；

Wl——肝臟重量（g）；

Wb——每尾魚體重（g）；

L——體長(zhǎng)（cm）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)，用LSD檢驗(yàn)法進(jìn)行均值間多重比較。統(tǒng)計(jì)分析所用的軟件為SPSS 11.5。

2 結(jié)果

2.1 投飼頻率對(duì)軍曹魚幼魚生長(zhǎng)性能的影響(見表3)

表3 投飼頻率對(duì)軍曹魚幼魚生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，各試驗(yàn)組的成活率在96.67%～100%之間，投飼頻率干預(yù)未對(duì)成活率產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。隨投飼頻率的增加各試驗(yàn)組WG增加，各投飼頻率下，RES組WG均高于MET組，投喂5次時(shí)，RES組WG顯著高于其余各組（P＜0.05）。在投喂5次時(shí)，RES組SGR顯著高于MET組（P＜0.05）。RES組在投喂3次時(shí)HIS顯著高于其他各組（P＜0.05），之后隨投喂次數(shù)的增加而下降；MET組日投喂3次和5次的CF顯著高于投喂2次的組（P＜0.05），RES組日投喂5次的CF顯著高于投喂3次的（P＜0.05）。

2.2 投飼頻率對(duì)軍曹魚幼魚體成分的影響（見表4）

MET組和RES組全魚粗蛋白隨各自投喂次數(shù)的增加各自未呈現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05），投喂5次時(shí)RES組粗蛋白含量顯著低于MET組（P＜0.05）；RES組粗脂肪含量隨投喂次數(shù)的增加而上升，但到5次時(shí)下降，4次時(shí)RES組粗脂肪顯著高于相同次數(shù)的MET組（P＜0.05）。

2.3 投飼頻率對(duì)軍曹魚幼魚消化酶活性的影響（見表5、表6）

表4 投飼頻率對(duì)軍曹魚幼魚全魚營養(yǎng)成分的影響(%干重)

表6 投飼頻率對(duì)軍曹魚幼魚肝臟消化酶活性的影響（U/mg·pro）

試驗(yàn)結(jié)果表明，MET組腸道的胰蛋白酶活性隨著投喂次數(shù)的增加有所下降，但在投喂5次時(shí)有所回升，顯著高于投喂4次的組（P＜0.05）；RES組腸道胰蛋白酶活性則在投喂3次時(shí)顯著高于其他各組（P＜0.05）；RES組腸道淀粉酶活性在投喂3次時(shí)顯著高于其在2次、4次和5次的處理組（P＜0.05），投喂5次時(shí)，MET組淀粉酶活性顯著高于RES組（P＜0.05）；投喂5次的RES組胃蛋白酶活性顯著低于其他各組（P＜0.05），MET組胃蛋白酶在投喂2次時(shí)活性顯著高于投喂次數(shù)相同的RES組和投喂5次的處理組（P＜0.05）。

表6顯示，MET組在投喂2次時(shí)肝臟胰蛋白酶活性較高，但是隨著投喂次數(shù)的增加有所下降，在投喂5次時(shí)有所回升（P＞0.05），RES組肝臟胰蛋白酶活性投喂4次時(shí)顯著高于其他各組（P＜0.05）；投喂次數(shù)增加肝臟總蛋白酶活性呈先增后降，投喂3次的MET組肝臟的總蛋白酶顯著高于其他各組（P＜0.05）；肝臟淀粉酶活性隨投喂次數(shù)的增加而上升，5次投喂的MET組顯著高于3次投喂組和2次投喂的RES組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 投飼頻率對(duì)軍曹魚幼魚生長(zhǎng)性能的影響

投飼頻率是影響營養(yǎng)物質(zhì)代謝的重要因素[13]，關(guān)系到魚類生長(zhǎng)、飼料轉(zhuǎn)化率、魚體規(guī)格和魚體代謝廢物等方面[14-16]。本試驗(yàn)中當(dāng)投飼頻率從日投喂2次增加到5次時(shí)，晶體蛋氨酸MET組的WG呈上升趨勢(shì)，但是差異不顯著，但是，投喂5次可以顯著提高微膠囊蛋氨酸RES組的WG，該組的PER和SGR也有相似變化趨勢(shì)。Zarate等認(rèn)為，若投飼頻率從日投喂2次增加到5次時(shí)，晶體賴氨酸和蛋白結(jié)合態(tài)賴氨酸對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的生長(zhǎng)沒有產(chǎn)生顯著影響；當(dāng)不考慮賴氨酸來源時(shí)，日投喂5次時(shí)斑點(diǎn)叉尾鮰的生長(zhǎng)優(yōu)于日投喂2次實(shí)驗(yàn)組[17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不考慮蛋氨酸來源，隨著投飼頻率的增加，WG增加。在低魚粉蛋白飼料中添加CAA，可能會(huì)比豆粕蛋白中釋放出來的氨基酸更快速吸收[18]。增加投飼頻率可以改善金頭鯛（Sparus aurata Linnaeus）[2]和鯉魚[19]對(duì) CAA的利用率。因此，CAA在消化道中吸收速度快于PAA，導(dǎo)致分解代謝升高，合成代謝降低[20]。由于水生動(dòng)物貯存游離氨基酸的能力甚低，導(dǎo)致先吸收的CAA不能用于合成蛋白質(zhì)(PAA尚未被吸收)而直接排泄或代謝；縮短投飼間隔后，可以使前次投飼時(shí)所產(chǎn)生的血液氨基酸依然保持在一個(gè)較高的水平而后一次投飼產(chǎn)生的血液氨基酸峰值可與前次產(chǎn)生一定程度的疊加，使CAA與其他來源于飼料PAA產(chǎn)生一定的互補(bǔ)，以便于氨基酸池達(dá)平衡滿足蛋白質(zhì)的合成，從而顯示出改善CAA的作用效果[21]。冷向軍等的研究表明，日投飼頻率為2次和3次時(shí)，低蛋白飼料中補(bǔ)充的晶體賴氨酸和蛋氨酸對(duì)異育銀鯽的生長(zhǎng)并無改善作用；但當(dāng)投飼頻率增加到4次后，異育銀鯽的生長(zhǎng)得到顯著改善，較不添加CAA的低蛋白對(duì)照組提高增重率12.5%[21]。

Batterham等認(rèn)為，日投喂1次時(shí)，豆粕中蛋白結(jié)合態(tài)賴氨酸比游離賴氨酸更能夠促進(jìn)豬的生長(zhǎng)，但是當(dāng)日投喂6次時(shí)生長(zhǎng)性能不受賴氨酸形式的影響，也就是說在豆粕為主要蛋白源時(shí)，投喂次數(shù)的增加改善了游離賴氨酸的利用[7]。用不同蛋白源（豆粕、血粉、肉骨粉等）替代魚粉，同時(shí)補(bǔ)充CAA后飼喂斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)，從表觀消化率的數(shù)值表現(xiàn)出CAA比PAA有更高的利用率，但是游離氨基酸的效率受到蛋白源的限制[19]。本試驗(yàn)中蛋白源除了豆粕外主要添加了肉骨粉。豆粕和肉骨粉都是蛋氨酸缺乏的飼料原料，其整體成分中某種或某些成分可能是影響蛋氨酸利用的因素之一，但是具體機(jī)制不清楚。

3.2 投飼頻率對(duì)軍曹魚幼魚體成分的影響

投飼頻率（日投喂2次和5次）對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰體成分含量沒有產(chǎn)生顯著影響[17]，歐洲螯龍蝦（Homarus gammarus L.）蛋白質(zhì)的合成和降解率沒有受到投飼頻率（1次/2 d、1次/4 d和1次/1 d）的影響[22]。然而，有研究表明，投飼頻率的增加顯著增加了大黃魚仔魚粗蛋白和粗脂肪含量[23]，黑鯛成魚和魚種的水分含量隨飼喂頻率的增高而增加，成魚脂肪含量隨飼喂頻率的增高而下降，魚種脂肪含量隨飼喂頻率的增高而增加[24]，投喂5次的虹鱒體蛋白質(zhì)顯著高于投喂1次的，而脂肪的含量則顯著低于投喂1次的[3]。增加投飼頻率有利于養(yǎng)分的沉積，在本試驗(yàn)中，投喂5次的MET組全魚粗蛋白含量顯著高于投喂4次和5次的RES組，投喂2次和3次的粗蛋白含量沒有受到顯著影響；日投喂4次的RES組粗脂肪顯著高于MET組。提示投喂5次時(shí)CAA與PAA的吸收相協(xié)調(diào)，能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的沉積。

3.3 投飼頻率對(duì)軍曹魚幼魚消化酶活性的影響

本試驗(yàn)中，軍曹魚幼魚胃蛋白酶活性在投喂2次時(shí)，MET組顯著高于RES組和投喂5次的處理組。飼料中的蛋白質(zhì)在胃部低pH值的條件下經(jīng)胃蛋白酶作用初步降解，因此試驗(yàn)中胃蛋白酶的變化可能主要由投飼頻率所引起。Rolls等（1972）研究表明，CAA比蛋白質(zhì)和肽更快速的通過老鼠的胃[25]，由于投飼頻率與胃排空的時(shí)間緊密相關(guān)[26-27]，隨投飼頻率增加可能刺激了胃排空速度加快，使食物消化不充分而導(dǎo)致投飼頻率增加胃蛋白酶活性下降。

較低或較高的投飼頻率會(huì)降低團(tuán)頭魴腸道消化酶活性[28]。大黃魚仔魚肝臟和腸道胰蛋白酶活性在投飼頻率由2次/d上升到8次/d時(shí)是顯著上升的，當(dāng)投飼頻率由8次/d上升到12次/d時(shí)，胰蛋白酶活性維持恒定[23]。本試驗(yàn)中RES組在日投喂3次時(shí)腸道胰蛋白酶活性顯著高于其他各組，而MET組則在日投喂5次時(shí)腸道胰蛋白酶活性達(dá)最高，肝臟總蛋白酶活性以投喂3次的MET組最高，可能與蛋氨酸在腸道中的釋放速度有關(guān)。MET和RES兩種蛋氨酸形式在腸道釋放速度是不同的，在不同的投飼頻率下，在某個(gè)特定時(shí)間恰好與其天然的有關(guān)消化和/或代謝酶的分泌、發(fā)揮作用或者合成的節(jié)律一致，酶的分泌和蛋白質(zhì)分解、蛋氨酸釋放以及蛋氨酸和PAA釋放的速度相吻合的程度恰好一致，有助于蛋白質(zhì)的分解利用[2]。本試驗(yàn)中WG和PER的變化和胰蛋白酶的變化趨勢(shì)并不一致。蛋白酶包括較多種，并且蛋白酶的分泌受到動(dòng)物種類、飼料種類和投飼策略等因素影響。歐洲鱸魚腸道蛋白酶的活性屬于隨晝夜差異而變化的酶，不管投飼頻率如何其活性只在晚上才增加[29]。食糜在消化道停留的時(shí)間也會(huì)影響消化酶的作用，隨著投飼頻率增加，消耗的飼料也隨之增多，每次攝食的時(shí)間間隔變短時(shí)，食物通過消化道的速度加快，導(dǎo)致消化效果下降[30]。

4 結(jié)論

綜上所述，增加投飼頻率可以改善軍曹魚幼魚的生長(zhǎng)性能和消化酶活性，促進(jìn)飼料中外源蛋氨酸的利用。投喂5次有利于晶體蛋氨酸對(duì)蛋白質(zhì)沉積作用的促進(jìn)，RES微膠囊蛋氨酸本身對(duì)蛋氨酸具有緩釋作用。投飼頻率的增加會(huì)導(dǎo)致攝餌行為增加，進(jìn)而體力和內(nèi)分泌組織的活動(dòng)增大，導(dǎo)致生長(zhǎng)和飼料轉(zhuǎn)化率下降。通過本次試驗(yàn)表明不同時(shí)間點(diǎn)軍曹魚對(duì)氨基酸的存在時(shí)間的差異，對(duì)進(jìn)一步改善微膠囊技術(shù)，定點(diǎn)釋放或緩慢釋放有一定的指導(dǎo)意義。從配方的角度入手，調(diào)整配方蛋白源的搭配、或者根據(jù)養(yǎng)殖對(duì)象在多次投喂所表現(xiàn)出來的生長(zhǎng)特性對(duì)氨基酸的包被技術(shù)進(jìn)一步改進(jìn)，增加壁材厚度延長(zhǎng)其釋放時(shí)間或定點(diǎn)釋放等，改善外源氨基酸的利用效果。