■張 霞 王學(xué)東 李 彪 彭思源 龔阿瓊胡先勤 鄭紅生

（1.武漢輕工大學(xué)，湖北武漢 430023；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；3.武漢市永生鴨業(yè)有限公司，湖北武漢 430077）

“鴨脖”是武漢的一張名片。但當(dāng)前為了得到更好的經(jīng)濟(jì)效益，養(yǎng)殖戶“購(gòu)一批鴨，拉一車(chē)藥”的現(xiàn)象令消費(fèi)者“恐懼”。藥物的濫用，導(dǎo)致病源微生物耐藥性(drug resistance)不斷增加，而養(yǎng)殖戶往往又通過(guò)加大用藥量或使用高效力藥品加以應(yīng)對(duì)，最終導(dǎo)致惡性循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)，從生物防控角度，利用“以菌（益生菌）治菌（致病菌）”的原理預(yù)防疾病，可減少各養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的用藥。

國(guó)內(nèi)外均在積極尋找抗生素代替品，其中活性益生菌(probiotics)是最具前途的安全生物制劑之一。而酵母菌(saccharomyces cerevisiae)作為益生菌已被許多國(guó)家和地區(qū)允許用于動(dòng)物養(yǎng)殖。酵母菌是一種典型的兼性厭氧型真菌，能夠調(diào)節(jié)胃腸道功能，抑制病原菌。且酵母在胃腸道內(nèi)能保持代謝活性，向腸道分泌多種營(yíng)養(yǎng)代謝產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、脂肪、糖及B族維生素等，也可以促進(jìn)小腸吸收氨基酸[1]。酵母細(xì)胞壁內(nèi)層含葡聚糖，這些大分子能激發(fā)非特異性和特異性免疫反應(yīng)，激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞[2]。同時(shí)酵母菌有耐受細(xì)菌類(lèi)抗生素作用。理想的益生菌菌株最好來(lái)自于腸道。

本研究旨在從肉鴨消化道內(nèi)分離篩選出酵母益生菌，通過(guò)26S rDNA分子方法、形態(tài)學(xué)和生理生化試驗(yàn)等鑒定酵母菌的種屬，為開(kāi)發(fā)高抗性、專(zhuān)一型的酵母益生菌制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

從宜昌肉鴨場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)（武漢江夏區(qū)）、散養(yǎng)農(nóng)戶（武漢水邊散養(yǎng)）、武漢肉鴨場(chǎng)4個(gè)地方分別選取生長(zhǎng)良好、健康、表現(xiàn)及精神狀態(tài)好的6只肉鴨(共計(jì)24只)。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基、高氏（Gorodkowa）瓊脂培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基、糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基、同化碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、同化氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、類(lèi)淀粉化合物液體培養(yǎng)基、無(wú)維生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基、尿素分解培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽葡萄糖培養(yǎng)基、高滲透壓培養(yǎng)基。

糖發(fā)酵培養(yǎng)基：D-葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖。

同化碳源培養(yǎng)基：乙醇、麥芽糖、纖維二糖、水楊苷、DL-乳酸、D-阿拉伯糖、棉子糖。

同化氮源培養(yǎng)基：硝酸鉀、L-賴(lài)氨酸、尸胺。

無(wú)維生素培養(yǎng)基：分別為不含有煙酸、吡哆醇、硫胺素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

以上培養(yǎng)基均為國(guó)產(chǎn)的化學(xué)純或者分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 試劑

山梨醇（Biosharp）、酵母基因組DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech）、Lyticase（Tiangen Biotech）、瓊脂糖、呂氏堿性美蘭染色、克酚紅等均為國(guó)產(chǎn)。

1.1.4 儀器設(shè)備

單人單面凈化工作臺(tái)（SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（LRHS-150-Ⅱ，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）、電泳儀（DYY-8C，北京市六一儀器廠）、PCR儀（TC-XP，BIO-RAD）、凝膠成像儀（Gel DocTMEZ，BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 肉鴨消化道酵母菌的采集與保存

按照解剖學(xué)位置，依次從肉鴨的腺胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸6個(gè)部位提取消化道內(nèi)容物，裝入封口袋后4℃保存。

1.2.2 酵母菌的分離純化

取6個(gè)部位消化道樣品用平板稀釋法在麥芽汁瓊脂平板上于28℃條件下培養(yǎng)2 d，挑取單菌落進(jìn)一步用平板劃線法純化2～3次。之后挑取少量純化后的菌體接種于YPD瓊脂斜面上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，然后將其放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆肹3]。

1.2.3 酵母菌的26S rDNA序列分析[4]

1.2.3.1 酵母基因組DNA提取

用酵母基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行26S rDNA的提取。

1.2.3.2 酵母菌26S rDNA片段擴(kuò)增和測(cè)序

用于26S rDNA PCR反應(yīng)引物：

上游引物 NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAG?GAAAAG-3'；

下游引物NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。

PCR反應(yīng)體系為50 μl，每管加入10× Taq Buffer 5 μl；20 μmol/l上下游引物各1 μl，2.5 mol/l dNTP 4 μl，模板 DNA 10 μl，5.0 U/μl Taq 0.5 μl。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s；55℃退火60 s；72℃延伸70 s，共進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)，最后再72℃繼續(xù)延伸10 min，4℃保藏。

測(cè)序：將純化后的PCR產(chǎn)物送到北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得到的序列與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的基因序列進(jìn)行同源性比較。

1.2.4 酵母菌的生理生化鑒定

1.2.4.1 酵母菌的形態(tài)學(xué)鑒定

依據(jù)田輝艷等[5]的方法進(jìn)行菌落特征觀察、細(xì)胞形態(tài)觀察、擲孢子的形成觀察、菌絲形成觀察和子囊孢子的形成觀察試驗(yàn)。

1.2.4.2 酵母菌的生理生化鑒定[5-7]

采用糖發(fā)酵試驗(yàn)、碳源同化試驗(yàn)、氮源同化試驗(yàn)、類(lèi)淀粉化合物形成試驗(yàn)、抗放線菌酮試驗(yàn)、無(wú)維生素生長(zhǎng)試驗(yàn)、尿素水解試驗(yàn)和耐高滲透壓試驗(yàn)進(jìn)行酵母菌種屬的鑒定。

2 結(jié)果

2.1 肉鴨消化道酵母菌分離結(jié)果

不同地區(qū)肉鴨的消化道各個(gè)部位分離的酵母菌見(jiàn)表1?？梢?jiàn)從宜昌肉鴨場(chǎng)肉鴨消化道6個(gè)部位分離出10株酵母菌；農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)肉鴨消化道6個(gè)部位分離出6株酵母菌；散養(yǎng)農(nóng)戶肉鴨消化道6個(gè)部位分離出12株酵母菌；武漢肉鴨場(chǎng)肉鴨消化道6個(gè)部位分離出7株酵母菌。本次總共分離得到了35株酵母菌。

2.2 酵母菌26S rDNA分子鑒定結(jié)果

2.2.1 酵母菌26S rDNA PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

用酵母基因組DNA提取試劑盒提取酵母菌株的26S rDNA，使用引物NL1、NL4對(duì)酵母菌株進(jìn)行26S rDNA的PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖4。從圖中可以看出，擴(kuò)增所得的產(chǎn)物大多在500～600 bp之間。

表1 不同地域肉鴨消化道酵母菌分布情況(株)

圖1 宜昌養(yǎng)殖場(chǎng)肉鴨消化道酵母菌26S rDNA擴(kuò)增電泳圖譜

圖2 農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)肉鴨消化道酵母菌26S rDNA擴(kuò)增電泳圖譜

圖3 散養(yǎng)農(nóng)戶肉鴨消化道酵母菌26S rDNA擴(kuò)增電泳圖譜

圖4 武漢養(yǎng)殖場(chǎng)肉鴨消化道酵母菌26S rDNA擴(kuò)增電泳圖譜

2.2.2 肉鴨各腸段的酵母菌株26S rDNA序列測(cè)序結(jié)果分析

將測(cè)序所得基因序列利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast軟件進(jìn)行基因序列同源性分析，結(jié)果見(jiàn)表2～表5。

表2顯示，從宜昌肉鴨場(chǎng)6只肉鴨消化道分離的10株酵母菌中，Candida albicans6株、Cryptococcus arboriformis1株、Kazachstania bovina2株、Candida parapsilosis1株。

表3顯示，從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的6只肉鴨消化道分離的6株酵母菌中，Candida albicans2株、Candida parapsilo?sis2株、Lodderomyces elongisporus1株、Kodamaea ohmeri1株。

表4顯示，從散養(yǎng)農(nóng)戶的6只肉鴨消化道分離的12株酵母菌中，Candida albicans1株、Cryptococcus arboriformis1株、Kazachstania bovina2株、Candida parapsilosis4株、Saccharomyces cerevisiae4株。

表5顯示，從武漢肉鴨場(chǎng)6只肉鴨消化道分離的7株酵母菌中，Candida glabrata2株、Candida albicans1株、Saccharomyces cerevisiae3株，Lodderomyces elongispo?rus1株。

表2 宜昌肉鴨場(chǎng)肉鴨消化道酵母菌26S rDNA測(cè)序結(jié)果分析

表3 農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)肉鴨消化道酵母菌26S rDNA測(cè)序結(jié)果分析

表4 散養(yǎng)農(nóng)戶肉鴨消化道酵母菌26S rDNA測(cè)序結(jié)果分析

表5 武漢肉鴨場(chǎng)肉鴨消化道酵母菌26S rDNA測(cè)序結(jié)果分析

綜合表2～表5可知，分離出的35株酵母菌長(zhǎng)度在500～650 bp之間，與模式菌株的基因序列同源性都在99%或100%。其中Candida albicans10株、Crypto?coccus arboriformis2株、Kazachstania bovina4株、Candida parapsilosis7株、Lodderomyces elongisporus2株、Kodamaea ohmeri 1株、Candida glabrata2株、Sac?charomyces cerevisiae7株。

由于目前的飼用酵母菌株中，只有釀酒酵母屬（Saccharomyces cerevisiae）是可以安全使用的，所以將分離的7株釀酒酵母編號(hào)為Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6、Y-7進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。

2.2.3 釀酒酵母菌株菌落形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果（見(jiàn)表6、表7）

由表6可知，Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6、Y-7菌株菌落都為乳白色，菌株大多為圓形或卵圓形，其無(wú)性繁殖方式為出芽生殖；Y-2、Y-4、Y-6、Y-7菌株均有假菌絲，都不產(chǎn)生擲孢子；子囊內(nèi)有1～2個(gè)光滑的圓形或卵圓形子囊孢子。

表6 7株釀酒酵母的形態(tài)學(xué)特征

表7 7株釀酒酵母的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

從表7可知，7株菌都能發(fā)酵D-葡萄糖、麥芽糖和蔗糖，都不能發(fā)酵乳糖。只有Y-4不能發(fā)酵半乳糖，其他菌株都能發(fā)酵，而Y-2和Y-6不能發(fā)酵蜜二糖，其他菌株都能發(fā)酵。碳源同化實(shí)驗(yàn)中都不能同化纖維二糖、水楊苷、D-阿拉伯糖、木糖醇、檸檬酸鹽和甲醇，Y-4不能同化乙醇，能同化蔗糖，其他菌株相反；只有Y-3菌株能同化D-半乳糖，其他菌株不能，麥芽糖、DL-乳酸、棉子糖都是有些菌株可以同化，有些不能同化。氮源同化試驗(yàn)中，7株菌都不能同化硝酸鉀、L-賴(lài)氨酸、尸胺。無(wú)維生素試驗(yàn)生長(zhǎng)試驗(yàn)中，無(wú)煙酸試驗(yàn)都顯陽(yáng)性，無(wú)吡哆醇試驗(yàn)中Y-2、Y-3、Y-6顯陽(yáng)性，其他幾株菌顯陰性；無(wú)硫胺素試驗(yàn)則是Y-2、Y-4、Y-5顯陽(yáng)性，其他顯陰性。另外，在0.01%放線菌酮試驗(yàn)、類(lèi)淀粉化合物形成試驗(yàn)、尿素分解試驗(yàn)和50%D-葡萄糖生長(zhǎng)試驗(yàn)中，7株菌都顯陰性。

根據(jù)《Yeasts Characteristies and Identification》[8]中所提供的檢索方法來(lái)進(jìn)行生理生化鑒定，其形態(tài)學(xué)、生理生化特性符合釀酒酵母屬特性。

3 討論

酵母益生菌是重要的飼用益生菌之一，其耐受腸道pH值變化，能調(diào)節(jié)腸道環(huán)境微生態(tài)平衡，提高動(dòng)物機(jī)體免疫能力。一般認(rèn)為，理想的益生菌菌株最佳來(lái)源為原籍動(dòng)物腸道。國(guó)內(nèi)關(guān)于腸道酵母益生菌的分離、鑒定的研究較少。魏亞松等[9]從水貂腸道分離出了2株酵母菌；胡秀彩等[10]和呂愛(ài)軍等[11]都從斑馬魚(yú)腸道中分離出酵母菌；張可毅等[12]將雞腸道分離的一株假絲酵母經(jīng)批量培養(yǎng)后飼喂肉雞，對(duì)肉雞生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用；田輝艷等[5]、周平[3]等分離了豬腸道酵母菌。而對(duì)肉鴨腸道酵母益生菌的分離、鑒定研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究從4個(gè)不同地域采集健康成年肉鴨消化道6個(gè)腸段（胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸)內(nèi)容物分離酵母菌，共分離出了35株酵母菌。

經(jīng)常能從宿主體內(nèi)分離到的菌株，而且數(shù)目較多，被稱(chēng)為常住菌，又叫原籍菌群。反之，不能經(jīng)常從機(jī)體分離出來(lái)的菌株為過(guò)路菌。本研究從4個(gè)不同地域肉鴨消化道采集的樣品，胃中雖都分離出了酵母菌，但是數(shù)量很少，其他消化道如十二指腸只有從散養(yǎng)農(nóng)戶肉鴨消化道采集的樣品分離出了酵母菌，回腸從宜昌肉鴨場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、散養(yǎng)農(nóng)戶肉鴨消化道采集的樣品都分離出酵母菌，但從武漢肉鴨場(chǎng)采集的樣品未分離出酵母菌，結(jié)腸只有從宜昌肉鴨場(chǎng)肉鴨消化道采集的樣品才分離出酵母菌，其他幾個(gè)地域采集的樣品都未分離出酵母菌，且數(shù)量都很少，證明酵母菌能耐受肉鴨消化道環(huán)境，但是在消化道中為過(guò)路菌。

Kurztman等[13-14]測(cè)定了所有已知酵母種類(lèi)的26S rDNA的D1/D2區(qū)域序列，發(fā)現(xiàn)這段區(qū)域序列變異性較高，且同一菌種在這個(gè)區(qū)域替代率一般不大于1%，而不同種的菌株差異更大，由此可以將絕大部分種區(qū)分開(kāi)。趙麗麗等[15]從葡萄、蘋(píng)果等樣品中分離出的18株酵母進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)域堿基序列分析，與基因庫(kù)中的基因序列進(jìn)行比對(duì)，同源性99%或100%，說(shuō)明此方法可以實(shí)現(xiàn)酵母菌種級(jí)水平鑒定。楊艷艷等[16]從工業(yè)污水處理池中分離耐堿酵母菌，通過(guò)26S rDNA 5’端D1/D2區(qū)基因序列分析，同源性為99.8%。

本試驗(yàn)對(duì)分離的酵母菌進(jìn)行26Sr DNA的D1/D2區(qū)段基因序列測(cè)定，與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)基因序列進(jìn)行比對(duì)，同源性均在99%或100%。分離出的35株酵母菌分別為Candida albicans10株、Cryptococcus arbori?formis2株、Kazachstania bovina4株、Candida parapsi?losis7株、Lodderomyces elongisporus2株、Kodamaea ohmeri1株、Candida glabrata2株、Saccharomyces cerevisiae7株。對(duì)7株釀酒酵母進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證26S rDNA的分析結(jié)果。根據(jù)農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄（2013）》征求意見(jiàn)稿中所列釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是屬于允許添加的飼用微生物。

4 結(jié)論

從4個(gè)不同地域的肉鴨消化道的6個(gè)部位共分離出35株酵母菌，其中有7株為釀酒酵母菌，這些菌株可作為肉鴨專(zhuān)用飼用酵母益生菌的備選菌株。