李勇慧， 馮愛青， 押輝遠(yuǎn)， 程彥偉， 逯海朋

(洛陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 河南 洛陽(yáng) 471022)

棗樹全基因組MITEs成分分析與系統(tǒng)進(jìn)化研究

李勇慧， 馮愛青， 押輝遠(yuǎn)， 程彥偉， 逯海朋

(洛陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 河南 洛陽(yáng) 471022)

微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座基因(minialure inverted repeat transposable elements, MITEs)的演化可能是造成棗樹基因組及品種多樣性的重要原因.為研究MITEs在棗樹全基因組中的分布、種類及演化，使用MITE預(yù)測(cè)軟件(MITE-Digger)識(shí)別棗樹全基因組中的MITEs序列，在植物MITEs數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分類注釋，并用MEGA 6.0構(gòu)建棗樹基因組中MITEs的系統(tǒng)進(jìn)化樹.結(jié)果顯示，MITE-Digger檢測(cè)出MITEs 總共3 230條，堿基數(shù)為1 104 679 bp，占基因組比例為0.34%；其中共有948條在植物MITEs數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)到相似序列，這些MITEs可以歸類到5個(gè)家族：hAT,PIF/Harbinger,CACTA,Mutator和Tc1/Mariner,MITEs系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示：棗樹基因組中MITEs來源于少數(shù)幾個(gè)共同祖先，在長(zhǎng)期的進(jìn)化中有明顯的擴(kuò)增和突變，這可能與棗樹品種多樣性有關(guān).研究結(jié)果將為棗樹的遺傳資源及育種研究提供重要參考.

MITEs； 棗樹基因組； 系統(tǒng)進(jìn)化； IMP分子標(biāo)記技術(shù)

0 引言

轉(zhuǎn)座因子(transposable element)是一類可移動(dòng)的DNA片段，在真核生物的基因組中分布非常廣泛.研究顯示轉(zhuǎn)座因子的活性在功能、結(jié)構(gòu)及進(jìn)化等方面對(duì)生物基因組有一定的影響，也是形成物種多樣性的主要原因之一[1-2].依據(jù)轉(zhuǎn)座機(jī)理的不同，把轉(zhuǎn)座因子分為兩種類型：Ⅰ型轉(zhuǎn)座元件，也稱反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(retrotransposon)，Ⅱ型轉(zhuǎn)座元件，也叫DNA轉(zhuǎn)座子(DNA transposon).按轉(zhuǎn)座活性的有無來劃分，DNA轉(zhuǎn)座子又分為自主型轉(zhuǎn)座子、非自主型轉(zhuǎn)座子和微型顛倒重復(fù)序列(MITEs).MITEs長(zhǎng)度一般為100～800 bp，比較短，包括末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)(terminal inverted repeats，TIRs)及靶位點(diǎn)的重復(fù)序列(target site duplication，TSD)，不能編碼轉(zhuǎn)座酶.MITEs與反轉(zhuǎn)座子類似的地方是拷貝數(shù)較高，研究發(fā)現(xiàn)它們和植物中很多基因相連，主要是由于它們有很強(qiáng)的插入低拷貝區(qū)域的偏好，能夠插入和跳出基因的某一片段[3].大部分的MITEs很可能來源于不同的DNA轉(zhuǎn)座子亞家族Tc1/mariner，PIF/IS5，CACATA，hAT或Mutator.通過對(duì)水稻基因組測(cè)序進(jìn)行分析顯示[4-5]，MITEs主要分布于常染色質(zhì)區(qū)，能夠形成巢式結(jié)構(gòu)，與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子不同.研究表明[6]，大多數(shù)MITEs都存在于靠近基因附近的非編碼區(qū).轉(zhuǎn)座子進(jìn)行轉(zhuǎn)座會(huì)對(duì)基因組的大小、結(jié)構(gòu)排列以及染色質(zhì)的組成成分產(chǎn)生一定的影響，從而進(jìn)一步影響到基因組的結(jié)構(gòu)、功能及進(jìn)化.

棗樹(ZizyphusjujubeMill.)果實(shí)是中國(guó)北方的主要水果之一.目前，有數(shù)百個(gè)棗樹品種，不同地區(qū)果實(shí)形狀、果肉味道和肉質(zhì)會(huì)有所不同，這可能與棗樹基因組的多樣性有關(guān).棗樹的這種多樣性可能與棗樹基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)座子有關(guān).MITEs是一類與基因組進(jìn)化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)座子，MITEs分子標(biāo)記技術(shù)IMP(inter-MITE polymorphisms)在許多植物中都已經(jīng)成功應(yīng)用.最近幾年有人開發(fā)了檢測(cè)MITEs的新軟件：MITE-Digger[6]，對(duì)分析從頭合成比較有效，尤其對(duì)基因組比較大的序列更有效.而且MITE-Digger分析的正確率高，錯(cuò)誤率低，且分析速度比較快，在Windows系統(tǒng)下就可以使用，所以本文采用MITE-Digger這個(gè)軟件來分析棗樹的基因組.鑒于目前棗樹基因組測(cè)序剛剛完成，MITEs在棗樹全基因組中的分布、種類、所占比例、棗樹基因組MITEs演化的研究還沒有報(bào)道，本研究試圖通過分析棗樹基因組中MITEs轉(zhuǎn)座子來研究棗樹基因組多樣性的原因，為棗樹多樣性研究和遺傳資源鑒別提供有力工具.

1 數(shù)據(jù)來源

棗樹的全基因組有12條染色體，從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載棗樹的全基因組(12條染色體，序列的NCBI號(hào)分別為CM003114.1，CM003115，CM003116.1，CM003117.1，CM003118.1，CM003119.1，CM003120.1，CM003121.1，CM003122.1，CM003123.1，CM003124.1，CM003125.1)，序列保存為FASTA格式.

2 生物信息學(xué)方法

2.1 基于MITE-Digger鑒定棗樹的全基因組MITEs

利用MITE-Digger軟件分析棗樹的全基因組.MITE-Digger在分析棗樹基因組序列時(shí)識(shí)別棗樹基因組中MITEs的運(yùn)行參數(shù)：MITE全長(zhǎng)100～800 bp(也就是大于100 bp小于800 bp的堿基序列鑒定為MITEs)；TSD堿基數(shù)范圍為>2；側(cè)翼序列不同堿基數(shù)的閾值為5 bp[7].

2.2 MITEs的注釋及分類BLAST

植物MITEs數(shù)據(jù)庫(kù)(plant MITE database,P-MITE)在對(duì)基因和基因組序列的注釋有很大的幫助和益處，它經(jīng)常被用于研究MITEs的起源和擴(kuò)增[8].我們通過P-MITE的BLAST(http://pmite.hzau.edu.cn/MITEblast/blast.htm)功能來注釋所得MITEs的歸類，從而找到相應(yīng)的MITEs所對(duì)應(yīng)的家族.

2.3 MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

將能夠注釋的MITEs序列以FASTA格式輸入MEGA 6.0,以最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用軟件默認(rèn)參數(shù).

3 結(jié)果與分析

3.1 棗樹MITEs的分布

MITE-Digger檢測(cè)出棗樹基因組中的MITEs總共3 230條，總堿基數(shù)為1 104 679 bp，占全基因組的比例為0.34%.共有948條在植物MITEs數(shù)據(jù)庫(kù)(P-MITE)中比對(duì)到相似序列，堿基數(shù)為323 856 bp，平均每339 201.0 bp出現(xiàn)一個(gè)注釋的MITE，占基因組比例為0.10%.各條染色體檢測(cè)出的MITE條數(shù)及占各染色體的比例如表1.

從表1中可以看出第4條染色體檢測(cè)出來的MITEs是最少的；第1條染色體檢測(cè)出來的MITEs是最多的；其他的幾條染色體檢測(cè)出來的MITEs相差不太大.平均每99 555.0 bp出現(xiàn)一個(gè)MITE，每個(gè)MITE的平均長(zhǎng)度為342.0 bp.還可以看出，每條染色體檢測(cè)出來的MITEs所占各自染色體的比例都很小，與水稻相比還是有一定差別的[9].

3.2 棗基因組MITEs的注釋及分類

通過序列比對(duì)，共有948條在P-MITE中找到相似序列，堿基數(shù)為323 856 bp，占基因組比例為0.10%.發(fā)現(xiàn)這些MITEs來源于5個(gè)DNA轉(zhuǎn)座子家族：hAT,PIF/Harbinger,CACTA,Mutator和Tc1/Mariner；還有一部分MITE沒有和任何DNA轉(zhuǎn)座子家族匹配上，這些MITE可能是棗基因組特有的.這5個(gè)家族的分布見表2.結(jié)果顯示主要分布在PIF，Mutator，hAT家族.

3.3 棗基因組中MITEs系統(tǒng)發(fā)育

MITE-Digger檢測(cè)出確認(rèn)的MITEs 總共3 230條，其中共有948條在P-MITE中比對(duì)到相似序列，對(duì)注釋上的MITEs利用MEGA 6.0構(gòu)建棗樹基因組MITEs的系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示.從圖中可以看出，此進(jìn)化樹分為4個(gè)類群Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ.其中第Ⅰ類群和ZRSiTEMT05900030(來源于玉米基因組中的一個(gè)MITE序列)在一個(gè)分枝上，類群Ⅱ和ORSgTEMT00100126(來源于水稻基因組中的一個(gè)MITE序列)，ORSgTEMT01601525(來源于水稻基因組中的一個(gè)MITE序列)，ZRSiTEMTOOT00002(來源于玉米基因組中的一個(gè)MITE序列)在一個(gè)分枝上，類群Ⅲ和ORSgTEMT00502514(來源于水稻基因組中的一個(gè)MITE序列)，ZRSiTEMT05600001(來源于玉米基因組中的一個(gè)MITE序列)在一個(gè)分枝上，證明它們和相應(yīng)的水稻、玉米基因組內(nèi)的MITEs具有一定的親緣關(guān)系，可能來源于一個(gè)共同的祖先.而類群Ⅳ沒有水稻、玉米基因組MITEs，說明是棗樹特有的類群.

從圖1還可以得出，這4個(gè)分支源于少數(shù)幾個(gè)共同的祖先，經(jīng)過長(zhǎng)期進(jìn)化中，祖先的基礎(chǔ)上有明顯的擴(kuò)增和突變，說明棗樹基因組MITEs的活動(dòng)處于不穩(wěn)定狀態(tài).分支Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ上各自的親緣關(guān)系都很近，這說明這3個(gè)分支上的MITEs在發(fā)育過程中進(jìn)行了一系列的擴(kuò)增，從而引起了棗樹基因組的多態(tài)性.在這3個(gè)分支中，分支Ⅱ上MITEs最多.

4 討論

由表1知棗樹中的MITEs 總共3 230條，總堿基數(shù)為1 104 679 bp，占基因組比例為0.34%，其中有948條在P-MITE中比對(duì)到相似序列，堿基數(shù)為323 856 bp，占基因組比例為0.10%.無論是檢測(cè)出來的總的MITEs，還是匹配上的MITEs,在棗樹基因組中所占的比例都很小.6種植物中MITEs所占的比例如表3所示[10].從表3中可以看出水稻中的MITEs所占的比例是最大的，高粱中的MITEs所占的比例是最小的，棗樹基因組中的MITEs所占的比例相對(duì)這幾種植物來說還不算太低，而且棗樹中MITEs的全長(zhǎng)為323 856 bp，平均長(zhǎng)度為341.26 bp，僅次于高粱，所以應(yīng)用MITEs轉(zhuǎn)座子來研究棗樹的基因組多樣性是比較可行的.

由圖1棗樹基因組MITEs的系統(tǒng)發(fā)育樹知，分支Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ上各自的親緣關(guān)系都很近，這說明這3個(gè)分支上的MITEs在發(fā)育過程中進(jìn)行了一系列的擴(kuò)增，從而引起了棗樹基因組的多態(tài)性.因此可以利用這3個(gè)分支上的MITEs的保守序列分別設(shè)計(jì)引物，來進(jìn)一步擴(kuò)增棗樹基因組內(nèi)的MITEs，以研究棗樹基因組的結(jié)構(gòu)和功能.同時(shí)還可以根據(jù)棗樹基因組內(nèi)MITEs的相對(duì)穩(wěn)定性來開發(fā)棗樹體內(nèi)的MITEs的分子標(biāo)記，以期研究棗樹基因組內(nèi)的MITEs所引起的基因多態(tài)性(IMP).應(yīng)用IMP研究不同遺傳背景的棗樹基因組的多態(tài)性，也就是說可以開發(fā)棗樹基因組的IMP引物.

人們已經(jīng)開發(fā)了許多基于轉(zhuǎn)座元件的分子標(biāo)記技術(shù).現(xiàn)在經(jīng)常用的分子標(biāo)記技術(shù)有RAPD，AFLP，RFLP，ISSR，SSR等[11-12].AFLP，RFLP和其他技術(shù)相比操作相對(duì)復(fù)雜，RAPD存在重復(fù)性和穩(wěn)定性較差的問題，而SSR要求知道重復(fù)序列的兩端的序列情況，并且費(fèi)用比較高，ISSR標(biāo)記技術(shù)在PCR擴(kuò)增時(shí)需要找到其最佳反應(yīng)條件，不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型.IMP分子標(biāo)記是以PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)，有可重復(fù)性的結(jié)果，設(shè)計(jì)引物是根據(jù)MITE的TIR序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，用來檢測(cè)兩個(gè)相鄰的MITE位點(diǎn)間的多態(tài)性，屬于共顯性的分子標(biāo)記技術(shù)[13].文獻(xiàn)[14]研究顯示MITE和它的側(cè)翼所在的部位是基因組中多態(tài)性比較高的區(qū)域，而且富含大量的AT重復(fù)序列，因而可以根據(jù)這些特點(diǎn)開發(fā)一些新的高效多態(tài)遺傳標(biāo)記IMP(inter-MITE polymorphism).而大量研究也表明IMP分子標(biāo)記技術(shù)已有效用于小麥、大麥、燕麥、玉米、甘蔗等許多禾本科植物的遺傳圖譜的構(gòu)建及遺傳分析研究[13,15-16].由表3知棗樹基因組內(nèi)的MITEs含量為0.34%，玉米基因組內(nèi)的MITEs含量?jī)H僅為0.001%，可以看出棗樹體內(nèi)的MITEs含量比玉米的要高，既然IMP分子標(biāo)記在玉米基因中可行，那么IMP在棗樹基因組中順利開發(fā)和實(shí)施相對(duì)來說還是可行的.雖然目前MITEs研究的進(jìn)展非常迅速，但已鑒定的MITEs仍然非常有限.本文對(duì)棗樹基因組中大量的MITEs的分離和鑒定進(jìn)行了研究，為從表觀遺傳方面來研究棗樹在栽培和移植過程中出現(xiàn)的一些變化的分子機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ).

總而言之，轉(zhuǎn)座元件是植物基因組中非常重要的組成部分，對(duì)于植物基因組的進(jìn)化以及基因表達(dá)都起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，所以MITEs對(duì)棗樹基因的表達(dá)和基因組的進(jìn)化調(diào)控等方面都有非常重要的意義.如果我們不了解轉(zhuǎn)座子的功能，就不可能對(duì)植物基因組的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化有一個(gè)明確的概念[17].因此對(duì)于轉(zhuǎn)座因子的深入研究將為了解棗樹基因組的組成和進(jìn)化秘密提供一把密匙，也會(huì)促進(jìn)棗樹相關(guān)遺傳育種理論與技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展.

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(責(zé)任編輯：王浩毅)

Analysis and System Evolution of MITEs in the Genome ofZiziphusJujubaMill

LI Yonghui, FENG Aiqing, YA Huiyuan, CHENG Yanwei, LU Haipeng

(LifeScienceCollege,LuoyangNormalUniversity,Luoyang471022,China)

The evolution of the MITEs might be the important cause of Chinese jujube genome and species diversity. In order to explore the distribution, types and evolution of MITEs in jujube genome, MITE prediction software (MITE-Digger) was used to identify the MITEs sequence of jujube genome, annotated in plant MITEs classified database. The phylogenetic tree of MITEs in jujube genome was built up with MEGA 6.0. The results indicated that the MITE-Digger detected 3 230 pieces of MITE, with 1 104 679 bp bases which account for 0.34% of the whole genome. The similar sequence compared had 948 pieces of MITEs in the plant MITEs database (P-MITE).These MITEs could be categorized into five families: hAT, PIF/Harbinger, CACTA, Mutator and Tc1/Mariner. MITEs phylogenetic tree showed that MITEs of jujube genome came from a few common ancestor, and had no obvious amplification and mutation in the long-term evolution, which might be related to the diversity of jujube varieties. The findings could provide important reference for genetic resources and breeding ofZiziphusJujuba.

MITEs; jujuba genome; system evolution; IMP

2015-07-10

NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金資助項(xiàng)目，編號(hào)U1204307；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目，編號(hào)15A2100410；洛陽(yáng)師范學(xué)院省級(jí)培育項(xiàng)目,編號(hào)2010-PYJJ-007.

李勇慧(1977—)，女，河南孟津人，副教授，碩士，主要從事植物學(xué)生物技術(shù)研究，E-mail:huiyongli8209@126.com；通訊作者：押輝遠(yuǎn)(1977—)，河南許昌人，副教授，博士，主要從事植物輻照研究，E-mail: yahuiyuan@lynu.edu.cn.

李勇慧，馮愛青，押輝遠(yuǎn)，等.棗樹全基因組MITEs成分分析與系統(tǒng)進(jìn)化研究[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，2015,47(4)：103-107.

Q949.4

A

1671-6841(2015)04-0103-05

10.3969/j.issn.1671-6841.2015.04.020