王 瓊 綜 述 盧慕峻 審 校

低氧誘導成體干細胞血管化

王 瓊 綜 述 盧慕峻 審 校

組織工程和再生醫(yī)學的發(fā)展，給組織器官功能修復提供了新的治療方法。但是，在病理條件下，移植干細胞極低的生存率嚴重限制了干細胞功能的發(fā)揮。因此，體外低氧預處理誘導成體干細胞血管化，成為改善成體干細胞抵御缺氧、疾病等的可能方案。我們對低氧誘導成體干細胞血管化中不同誘導條件，及不同成體干細胞的優(yōu)缺點的相關研究進行綜述，以尋找較為理想的誘導血管化方案。

低氧成體干細胞血管化

機體正常功能狀態(tài)的保持依賴于適宜的氧氣供給，軟組織損傷后，周圍的微環(huán)境因血供減少而處于低氧狀態(tài)。因此，軟組織修復過程中血管生成具有十分重要的作用，缺氧狀態(tài)被認為是血管發(fā)生的一種重要的刺激因素。

血管生成過程極其復雜，多種細胞因子，如VEGF、PGDF及TGF等，均參與其中，包括了內皮細胞移行、內皮細胞增殖、內皮細胞管道化分支形成血管環(huán)和形成新的基底膜等步驟。一般情況下，血管內皮細胞（Endothelial cell，EC）生長期有限，經多次傳代后形態(tài)及生物學特性會有所改變，不宜長期傳代培養(yǎng)。成體干細胞具有多向分化能力，不受傳代限制，而備受矚目。

實驗證明，干細胞可以促進缺血組織的血管化[1-2]。低氧條件引起成體干細胞血管化的機理，一是成體干細胞通過氧化還原代謝及旁分泌內分泌等途徑促進血管化，二是成體干細胞直接分化為與血管化相關的EC及血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）等。大量研究表明，低氧條件能夠上調細胞缺氧誘導因子-1（Hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）的表達，而HIF-1通過調節(jié)促紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）及VEGF等編碼基因，而調控血管生成的過程[2-5]。近期研究表明，低氧條件可以促進SDF-1的受體CXCR4及CXCR7表達上調，增加其對SDF-1的敏感性[6-8]。相同氧分壓條件下，不同成體干細胞促進分化的趨勢是有差別的，同種干細胞在不同氧分壓條件下的分化及增殖趨勢也是不同的[9]。

1 骨髓間充質干細胞（BMSC）

BMSC是骨髓中非造血實質細胞的干細胞，具有多向分化潛能，體內BMSC微環(huán)境的氧氣濃度為1%~2%[10]，低氧環(huán)境對BMSC生存及功能維持起重要作用[11]。D'Ippolito等[12]發(fā)現(xiàn)，隨著氧氣濃度的降低，BMSC的增殖能力逐漸增加；Ziegelhoeffer等[13]發(fā)現(xiàn)，BMSC在生理或病理條件下并不能參與血管形成，只是作為一個支持細胞旁分泌的相關細胞因子作用于缺血組織；Kinnaird等[5]發(fā)現(xiàn)，移植BMSC后的小鼠主要是由BMSC旁分泌相關細胞因子促進損傷組織的血管化，而并沒有觀察到干細胞分化形成EC；而Al-Khaldi等將BMSC移植至小鼠損傷模型，發(fā)現(xiàn)BMSC可以分化為CD31陽性的血管內皮細胞（EC），損傷組織鏡下可觀察到血管樣組織[14]。Annabi等[15]將BMSC接種于人造三維膠質膜上培養(yǎng)4 h后發(fā)現(xiàn)，1%低氧條件產生的三維毛細血管樣結構比常氧條件多了約4倍，相關HIF-α、VEGF及其受體Flk-1、成纖維細胞生長因子（bFGF）等基因表達上調，證明了低氧條件可以迅速促進血管化。

相關研究發(fā)現(xiàn)，低氧能夠誘導BMSC的SDF-1受體CXCR4及CXCR7的表達上調，并影響VEGF、HIF-1α及活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的表達[7-8，16]；SIRT1基因在低氧條件下具有重要的調節(jié)BMSCs增殖及分化的作用，它能夠調節(jié)HIF-1α的表達[4，17]；Annabi等[15]發(fā)現(xiàn)，MT1-MMP蛋白的催化結構域受抑制可以強烈阻止干細胞形成毛細血管樣結構，而低氧條件下能夠誘導MT1-MMP基因過表達，說明MT1-MMP基因可能與低氧誘導干細胞血管化有關；同時，低氧引起MMP-2基因表達下調，而MMP-2基因與干細胞血管化之間的關系仍不清楚。

綜上所述，我們可以推測，在生理狀態(tài)下，組織損傷后，血液中本身存在的血管內皮祖細胞或者原位的血管內皮祖細胞分化為EC，而BMSC僅作為一種支持細胞通過旁分泌及內分泌等途徑促進損傷組織血管化。體內試驗中，對于移植到小鼠缺血模型的BMSC，其促進血管化的機理有兩種可能，一是BMSC通過旁分泌內分泌等途徑而促進血管化，二是BMSCs直接分化為與血管化相關的血管內皮細胞及血管平滑肌細胞等。而究竟是何種機理占主導作用，仍需要進一步探索。體外實驗中，單純低氧條件可以迅速促進BMSC血管化，但BMSC數(shù)量與骨髓中總細胞數(shù)之比約為1/100 000~ 1/25 000[18]，且年齡越大，BMSC的數(shù)量越少[19]。來源較少在一定程度上限制了BMSC的臨床應用。

2 脂肪間充質干細胞（ADSC）

ADSC是脂肪組織中一類多能性干細胞，小鼠體內ADSC的微環(huán)境氧氣濃度為3%[20]。不同位置的脂肪細胞，在解剖、生理及細胞水平上是不同的[21]；間充質干細胞有多種亞型，不同亞型的干細胞功能也是有差異的[22]。Barros等[23]利用缺氧鼠模型，通過肌肉注射將低氧預處理的ADSC植入損傷組織，結果發(fā)現(xiàn)高齡組鼠的血液灌流較對照組多了1.4倍，而年輕組的卻少了1.2倍，免疫熒光證明ADSC并沒有分化成血管內皮細胞的能力；人體內試驗發(fā)現(xiàn)低氧處理24 h的ADSC并不能促進低年齡組（20~35歲）損傷組織的血管化。大量體外研究證明，單純低氧條件不能誘導ADSC分化為EC，卻能促進其VEGF、HIF-1α等的表達[23-26]，而ADSC促進血管化也絕不僅僅是VEGF的單獨作用[5，25]；劉林奇等[27]發(fā)現(xiàn)，低氧條件下VEGF及bFGF的表達增高，而HGF表達卻沒有變化；單純低氧條件與常氧條件處理ADSC相比，EC特征性免疫標記CD31及FLK-1的表達沒有顯著變化[6]；1%氧濃度下，ADSC具有更強的抵御缺氧等惡劣微環(huán)境的能力[24]。

相關研究表明，低氧條件可以促進脂肪干細胞SDF-1的受體CXCR4表達上調，增加其對SDF-1的敏感性[6]；Barros等[23]發(fā)現(xiàn)，低氧能夠促進ROS的產生，進而引起VEGF等表達上調，從而促進其血管化。Jiang等[28]發(fā)現(xiàn)，HIF-1α、VEGF及BNiP3的表達隨著氧濃度的下降而逐漸升高，而在1%氧濃度下，其值達到最高，但BNiP3被認為與細胞凋亡密切相關，而Bcl-2作為一個原癌基因，其表達在3%氧濃度時最高。

綜上所述，無論體內或體外實驗，單純低氧不能誘導ADSC分化為EC，但能夠促進其相關細胞因子的表達，從而促進血管化。ADSC取自脂肪組織，來源較廣，容易獲得，但相比BMSC，其促血管化能力較低。

3 其他類型的成體干細胞

人羊膜間充質干細胞（Human amniotic mesenchymal stromal cells，hAMSC）多取自于產后的胎盤組織，基本不存在倫理爭議。hAMSC有分化為內皮細胞的能力[29]，相比ADSC和BMSC，hAMSC擁有更強的增殖能力[30]。小鼠體內實驗發(fā)現(xiàn)，將來自人臍帶間充質干細胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSC）的微囊泡移植到缺血損傷的腎組織，能夠改善缺血腎臟組織的損傷程度，有明顯抗炎抗纖維化的組織修復作用，但其抵抗損傷、促進修復的具體機制仍不清楚[31]。目前，有關低氧誘導hAMSC、hUMSC及其他類型成體干細胞的研究相對較少，但其優(yōu)越的增殖分化能力有可能使其成為將來的研究熱點。

4 低氧條件

不同的氧濃度對同一種成體干細胞的增殖分化能力有不同的影響[6，28]；相同氧濃度作用不同時間，其影響亦不盡相同[25]。研究發(fā)現(xiàn)，5%氧濃度預處理的ADSC增殖能力下降，但卻有向軟骨細胞分化的趨勢[32]；Rasmussen等[25]發(fā)現(xiàn)，相比1%氧氣條件和常氧條件，在5%的氧氣條件下，ADSC擁有更高的增殖能力，而其在1%氧氣條件下細胞死亡率更高；Jiang等[28]認為，3%的氧濃度為ADSC體外培養(yǎng)的最佳低氧條件；Barros等[23]使用0.5%氧濃度預處理皮下脂肪組織24 h，能夠逆轉因高齡引起的ADSC分化為EC能力降低的問題；Rasmussen等[25]延長低氧作用于ADSC的時間，可以增加其VEGF的表達；Thangarajah等[6]在體外不同氧濃度（21%、5%及1%）及不同時間（1、2、3 d）培養(yǎng)預處理ADSC，結果發(fā)現(xiàn)氧濃度越低、培養(yǎng)時間越長，VEGF的表達越高。

對于誘導成體干細胞血管化的最佳低氧濃度，目前仍存在較大爭議，但可以確定成體干細胞血管化的能力與低氧作用的時間呈正相關。

5 培養(yǎng)方式

Hamou等[1]將加入50 ng/mL VEGF的培養(yǎng)基培養(yǎng)ADSC 5 d（2.5%的氧濃度下）后發(fā)現(xiàn)DiI-acLDL（血管內皮祖細胞標志物）陽性細胞，常氧條件下BMSC與bEND.3細胞共培養(yǎng)5 d后發(fā)現(xiàn)CD31陽性細胞，證明了VEGF及細胞共培養(yǎng)可以促進BMSCs及ADSCs向血管內皮細胞的分化。Thangarajah等[6]在體外培養(yǎng)ADSC，對比常氧組、單純低氧組、低氧+VEGF組與低氧條件bEND.3細胞共培養(yǎng)組的ADSCs血管化能力：低氧組較常氧組VEGF表達增高，但CD31及FLK-1表達（EC相關）沒有顯著變化，低氧+VEGF組相比低氧組，CD31及FLK-1表達明顯增高，而ADSCs與bEND.3細胞共培養(yǎng)組相比其他組擁有最好的血管化效果，可以發(fā)現(xiàn)毛細血管樣組織，說明了異型細胞間的作用在血管生成中的重要作用。其他一些研究還發(fā)現(xiàn)，經胰蛋白酶處理后的干細胞產生VEGF及IGF的能力較未處理組要高[25]；Barros等[23]發(fā)現(xiàn)，低氧加上乙酰半胱氨酸培養(yǎng)ADSC，對比僅低氧處理，VEGF表達明顯降低；郝曉娟等[33]發(fā)現(xiàn)，缺氧預處理200 μmol/L氯化鈷培養(yǎng)液對hUMSC分化為內皮樣細胞有促進作用；相比二維支架，三維支架培養(yǎng)的干細胞有更高的可塑性以及更大的細胞間作用能力[9]，而三維支架材料包括人工合成高分子聚合材料、納米材料等，不同的支架對在其上生長的細胞有不同的影響。另外，Darland等[34]發(fā)現(xiàn)，TGF-β能夠促進小鼠胚胎間充質干細胞（Embryonic mesenchymal stem cells，EMSC）分化為VSMC，促進血管基底膜的形成，從而增加新生血管的穩(wěn)定性，而EC周圍的EMSC起到引導及模板的作用。而TGF-β分為多種亞型，具體哪種亞型起到關鍵作用以及TGF-β是否對成體干細胞具有同樣作用還需進一步研究。

不同的體外培養(yǎng)條件對成體干細胞血管化有不同影響，低氧加上細胞因子，以及低氧條件下細胞共培養(yǎng)相比單純低氧條件誘導成體干細胞，具有更好的促血管化效果。氧氣濃度、相關細胞因子、共培養(yǎng)細胞及三維支架材料的選擇及優(yōu)化，成為促進成體干細胞血管化的研究方向。此外，TGF-β對穩(wěn)定血管的特殊作用，可能作為將來促進血管化的選擇條件之一，而胰蛋白酶預處理及其他相關培養(yǎng)條件，對于促進成體干細胞血管化的作用亦不容忽視。

6 小結

利用組織工程和再生醫(yī)學進行損傷組織的修復，是目前較為理想的治療模式，而體外干細胞的血管化具有極其重要的作用，如何快速血管化及增加新生血管的穩(wěn)定性，是當前研究的重點和難點。成體干細胞作為一類多能干細胞，因其較胚胎干細胞更易獲得、不涉及倫理問題、具有多向分化潛能而在近年來備受青睞，體外誘導BMSC血管化條件相對簡單，單純低氧甚至常氧條件下即可誘導其血管化，但其來源及體外擴增問題限制了其廣泛應用。ADSC相對較易獲得，但血管化能力弱于BMSC，單純低氧不能誘導其血管化。較為常用的低氧誘導濃度為1%、3%及5%，但其最佳培養(yǎng)氧濃度仍存在爭議。近年來，相關誘導成體干細胞血管化的研究雖取得一定成果，但至今還沒有誘導BMSC及ADSC血管化條件的具體標準，包括低氧條件、培養(yǎng)時間、細胞因子、干細胞的類型、支架材料等。其他如hAMSC及hUMSC等，因具有優(yōu)越的增殖分化能力有望成為以后的研究發(fā)展方向。已發(fā)現(xiàn)HIF-α及SDF-1等通路與低氧引起成體干細胞血管化有關，但具體機制仍需進一步探究。

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Angiogenesis of Adult Stem Cells Induced by Hypoxia

WANG Qiong,LU Mujun.

Department of Urology,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.
Corresponding author: LU Mujun(E-mail:lumujun@163.com).

【Summary】In recent years,tissue engineering and regenerative medicine provide a new method to treat the damaged tissues and organs,but under the pathological conditions,the low survival rate of the transplanted stem cells limits its function.Because of this,hypoxic preconditioning of the stem cells in vitro become a new solution to improve its ability to resist hypoxia and injury.In this paper,the advantages and disadvantages of different inducing conditions and different adult stem cells were reviewed to search the ideal conditions of angiogenesis.

Hypoxia;Adult stem cell;Angiogenesis

Q813.1

B

1673－0364（2015）04－0274－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.04.015

2015年3月29日；

2015年5月6日）

國家自然科學基金面上項目（No.81370860）。

200011上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院泌尿外科。

盧慕峻（E-mail：lumujun@163.com）。