周雪+曹淑瑞+李賢良+郗存顯+徐芬+陳志瓊

摘 要 采用分散固相萃取（QuEChERS）前處理方法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）建立出口蔬菜中16種保鮮劑殘留量的快速檢測方法。以葉菜類、茄果類、豆類、瓜類和塊莖類出口蔬菜為原料，樣品經(jīng)乙腈提取，QuEChERS除雜凈化，用GC-MS外標(biāo)法進行定量分析。16種保鮮劑在0.02～2.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9990～0.9997，檢出限（LOD，S/N=3）在0.004～0.965 μg/kg范圍內(nèi)。以0.01， 0.02和1.0 mg/kg添加濃度水平進行方法學(xué)驗證，回收率為76.7%～120.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～10.6%。與國標(biāo)GB/T 19648-2006等方法相比，本方法具有快速、簡便、靈敏度高等特點，能滿足出口蔬菜中16種保鮮劑殘留的檢測要求。

關(guān)鍵詞 分散固相萃取; 出口蔬菜; 保鮮劑; 氣相色譜-質(zhì)譜法

1 引 言

內(nèi)陸蔬菜出口長距離運輸易腐敗變質(zhì)^[1]，不規(guī)范使用或濫用蔬菜保鮮劑會導(dǎo)致保鮮劑超標(biāo)。蔬菜保鮮劑主要分為天然保鮮劑和化學(xué)保鮮劑，由于化學(xué)保鮮劑價格低廉且易于操作，故在蔬菜儲藏運輸中應(yīng)用較廣^[2]?；瘜W(xué)保鮮劑殘留量過大， ?不僅會影響出口蔬菜的質(zhì)量，還可能嚴(yán)重影響消費者健康，有些保鮮劑甚至可能導(dǎo)致癌癥及一些神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生[3， 4]。眾多的檢測項目和較長的檢測周期不僅給新鮮蔬菜收購、出口通關(guān)帶來不便，還導(dǎo)致蔬菜保鮮品質(zhì)下降。研發(fā)多種保鮮劑殘留同時、快速、高靈敏度的分析方法，對提升出口蔬菜中保鮮劑殘留的檢測水平和加大監(jiān)管力度起著重要作用。

常用的保鮮劑殘留檢測方法主要有免疫分析法^[5]、生物傳感器^[6]、液相色譜法^[7]、液相色譜-質(zhì)譜法^[8]、氣相色譜法（GC）^[9]和氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）^[10]等。其中，GC的分離效能高、分析速度快，質(zhì)譜則提供準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)信息，GC-MS已成為多種保鮮劑殘留分析最為有力的方法之一。謝建軍等^[11]采用GC-MS法對果蔬中嘧霉胺、百菌清、丙環(huán)唑、三唑酮等多種保鮮劑殘留同時檢測進行了報道。崔淑華等^[12]應(yīng)用GC-MS法對果蔬中腈菌唑、丙環(huán)唑、三唑酮等保鮮劑在內(nèi)的193種農(nóng)藥殘留同時進行了檢測。由于各種保鮮劑理化性質(zhì)的差異性，同時檢測多種保鮮劑殘留的樣品前處理方法需滿足較寬范圍的化合物，如直接對樣品進行稀釋或以固相萃取小柱進行凈化，前者未能去除雜質(zhì)，干擾較多;后者耗時較長，不利于通關(guān)放行。分散固相萃取是近年發(fā)展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速樣品前處理技術(shù)， 該方法不僅能有效凈化樣品，還具有耗時短、操作簡便、使用溶劑少等優(yōu)點。

本研究對出口蔬菜中同時提取16種保鮮劑的溶劑進行了篩選，同時考察了乙酸銨緩沖溶液的作用，優(yōu)化了分散固相萃取等凈化條件，充分利用了GC-MS分離效率高、靈敏度高、專屬性強的優(yōu)點，建立了同時快速檢測出口蔬菜中16種保鮮劑殘留量的方法。本方法具有高的準(zhǔn)確度和精密度，可為出口蔬菜中保鮮劑殘留量的快速檢測提供技術(shù)支持。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

7890-5975C氣相色譜-質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）;BS224S型天平（德國Sartorius公司）;渦旋振蕩混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）;3-30K臺式高速冷凍離心機（德國 Sigma公司）;4011 Digital旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）;系列Eppendorf移液器（可調(diào)范圍：10～100 μL，20～200 μL，10～1000 μL，1000～5000 μL，1～10 mL，德國Eppendorf公司）。

16種保鮮劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度均≥99%，美國AccuStandard公司）;乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、甲苯（色譜純，美國Tedia公司）;PSA（乙二胺-N-丙基硅烷，粒度60μm）、ODS（十八烷基硅烷鍵合硅膠、C18，粒度60 μm）均購于美國Agilent Technologies公司;C18固相萃取柱（6 mL，0.50 g）、活性炭固相萃取柱（6 mL，0.50 g）、NH2固相萃取柱（6 mL，0.50 g）、ENVI-CARB/LC-NH2固相萃取柱（6 mL，0.50 g）均購于美國SUPELCO公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純;實驗用水為Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備的超純水;蔬菜均購于本地超市。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.01 g于燒杯中，加入少量丙酮，待完全溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，并用丙酮定容，配制成1000 mg/L單標(biāo)儲備液。移取各個單標(biāo)儲備液，配制成20 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。儲備液均置于 Symbolm@@ 18 ℃避光保存。儲備液用丙酮逐級稀釋，配制成系列工作溶液。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件

DB-5 MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;載氣為高純度氦氣，流速1.2 mL/min;不分流進樣，進樣體積1 μL;進樣口溫度250 ℃;柱溫程序：初溫70 ℃，保持2 min，然后以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，總運行時間 28 min。離子源：EI源，電離能量70 eV;離子源溫度：230 ℃;四級桿溫度：150 ℃;接口溫度：280 ℃;溶劑延遲：5 min。endprint

2.4 樣品前處理

稱取蔬菜勻漿10.0 g于50 mL螺旋蓋聚四氟乙烯離心管，加入10 mL乙腈、4 mL 2 mol/L 乙酸銨溶液，渦旋振蕩2 min，加入5.0 g NaCl，渦旋 1 min，5000 r/min離心3 min，取有機相。重復(fù)提取一次，合并有機相。取10 mL有機相于15 mL螺旋蓋聚四氟乙烯離心管中，加入100 mg PSA、150 mg ODS、500 mg 無水MgSO4，渦旋1 min，以5000 r/min離心3 min，取上清液于25 mL旋蒸瓶中，在低于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至凈干，用丙酮定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾至氣相進樣瓶中，待GC-MS測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

3.1.1 提取劑的選擇 由于16種保鮮劑極性存在一定差異性，因此選用常用的丙酮（AC）、丙酮-乙酸乙酯（AC-EAC，1∶1， V/V）、正己烷-乙酸乙酯（Hex-EAC，1∶1， V/V）、乙腈（AN）分別進行加標(biāo)回收實驗，以選取合適的提取溶劑。結(jié)果如圖1（未加入乙酸銨緩沖溶液調(diào)pH值）所示，乙腈的提取回收率相對較好，故實驗采用乙腈作為提取劑。

對羥基苯甲酸酯類保鮮劑顯弱酸性，調(diào)節(jié)溶液pH值，使組分處于分子狀態(tài)，易被有機溶劑萃取，基于上述原理，考慮加入乙酸銨緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值。文獻[13]報道，加入2 mol/L 乙酸銨緩沖溶液后，對羥基苯甲酸酯類保鮮劑的回收率增大，且對其它保鮮劑的回收率沒有影響。本實驗對2 mol/L 乙酸銨溶液加入體積（0， 2， 4， 6和10 mL）進行了考察，當(dāng)乙酸銨溶液的加入體積為4 mL時，對羥基苯甲酸酯類保鮮劑的回收率最佳，故本實驗在提取過程中加入4 mL 2 mol/L乙酸銨緩沖溶液。

3.1.2 凈化條件的選擇

在QuEChERS文獻報道中，主要使用PSA， ODS和GCB吸附劑[9， 11， 14， 15]對提取液進行凈化，GCB雖然能夠有效去除色素，但也會使多酚類和其它極性化合物回收率過低，故擬選用PSA、ODS達到好的凈化和回收效果。本實驗通過加標(biāo)回收實驗確定吸附劑用量，以甘藍為基質(zhì)，各保鮮劑的添加水平均為0.05 mg/kg，當(dāng)ODS用量不變，PSA的用量分別為0， 50， 100， 150和200 mg時，凈化結(jié)果見圖2。當(dāng)PSA用量為100 mg時，16種保鮮劑的回收效果較好。

當(dāng)PSA用量為100 mg時，改變ODS 用量（0， 50， 100， 150和200 mg），各保鮮劑的回收率相差不大，故對各水平ODS凈化后的甘藍空白樣品譜圖進行重疊分析，見圖3。根據(jù)質(zhì)譜信息，殘留量較多的雜質(zhì)分別是N， N′-二乙基草酰胺、苯胺、5-乙酯基氨基-8-甲氧基喹啉。由圖3可見，150 mg ODS對苯胺的凈化效果最好，原因可能有3個方面：（1）非極性相互作用：苯胺的母核苯基與非極性吸附劑ODS之間的作用力，這種作用力在極性溶劑乙腈中有較好的體現(xiàn)，也稱疏水作用;（2）ODS顆粒表面殘留的硅羥基會與極性化合物苯胺發(fā)生次級相互作用，即發(fā)生氫鍵作用;（3）硅羥基解離后會和堿性化合物苯胺發(fā)生離子相互作用。ODS對N， N′-二乙基草酰胺的凈化作用不好，N， N′-二乙基草酰胺極性很強，故不存在非極性相互作用，推測非極性相互作用起主導(dǎo)作用。50 mg ODS對5-乙酯基氨基-8-甲氧基喹啉凈化效果最好，喹啉的極性很小，非極性相互作用起主導(dǎo)作用。綜合考慮，ODS用量定為150 mg。

在傳統(tǒng)實驗中，若濃縮時溶劑較少，通常采用氮氣吹干方式。由于本實驗提取溶劑選用乙腈，采用氮氣吹干方式耗時較長，故采用旋轉(zhuǎn)抽干模式進行濃縮。實驗表明，兩者的回收效果相當(dāng)，故采用旋轉(zhuǎn)抽干模式以提升實驗效率。

3.2 與其它方法進行對比

將本方法與GB/T 19648 2006^[14]、GC-MS聯(lián)用測定果蔬中6種防腐殺菌劑檢測方法 [16]以及EN 165662-2008^[15]進行了比較。GB/T 19648 2006采用凈化方式，先經(jīng)C18固相萃取柱，再經(jīng)活性炭固相萃取柱和NH2固相萃取柱串聯(lián)柱凈化;而文獻[16]未經(jīng)過凈化。實驗結(jié)果表明，采用國標(biāo)方法的凈化方式， 對羥基苯甲酸酯、聯(lián)苯醚的回收率不及本方法，且耗時過長，實驗效率低;文獻[16]所用時間少，回收率也相對較好，但雜質(zhì)多，對儀器的損傷很大，且會對回收率造成假陽性。本方法采用了歐盟EN 165662-2008^[15]的QuEChERS凈化方法，但是在提取過程中加入了乙酸銨溶液，且采用ODS凈化，更利于16種保鮮劑的同時提取和凈化處理。結(jié)果見表1。

3.3 線性關(guān)系、標(biāo)準(zhǔn)曲線以及檢出限

用丙酮將標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋成濃度為0.02～2.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在設(shè)定的儀器條件下進行測定。以目標(biāo)物定量離子的峰面積對相應(yīng)的質(zhì)量濃度（mg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，16種保鮮劑在0.02～2.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。以3倍S/N計算16種保鮮劑的檢出限。通過儀器分析目標(biāo)物的質(zhì)譜圖并結(jié)合文獻，確定各化合物的特征離子。16種保鮮劑的保留時間、選擇離子、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)以及檢出限見表2。

3.4 方法的回收率與精密度

分別向甘藍、黃瓜、四季豆、茄子、胡蘿卜等多種蔬菜勻漿中添加不同濃度的16種保鮮劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平分別為0.01，0.02和1.0 mg/kg，按2.4節(jié)所述實驗方法進行測定。以茄子為例，各保鮮劑的平均回收率在76.7%～120%范圍內(nèi);RSD在2.1%～10.6%范圍內(nèi)（表3）。endprint

3.5 實際樣品檢測

從本地超市購得甘藍、白花菜、藠頭及辣椒等蔬菜，按照本實驗選擇的最優(yōu)條件進行提取凈化和分析，結(jié)果見表4。雖然在部分蔬菜中檢出部分保鮮劑，但其含量均未超過國家規(guī)定的蔬菜保鮮劑最高殘留量。

結(jié)果表明， 本方法在提取溶劑中加入乙酸銨溶液，有利于對羥基苯甲酸酯的提取，用PSA、ODS進行了QuEChERS凈化。與其它保鮮劑多殘留分析方法相比，本方法具有操作方法簡單、分析時間短、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，能為出口蔬菜的快速通關(guān)提供技術(shù)保障。

References

1 PanstrugaR， ?Schulze-Lefert P. Microbes and Infection， ?2003， ?5（5）： 429-437

2 ZHOU Xue， ?CAO Shu-Rui， ?LI Xian-Liang， ?XI Cun-Xian， ?XU Fen， ?CHEN Zhi-Qiong. Journal of Anhui Agri. Sci.， ? 2014， ?42（17）： 5614-5616

周 雪， 曹淑瑞， 李賢良， 郗存顯， 徐 芬， 陳志瓊. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， ?2014， ?42（17）： 5614-5616

3 Kirkhorn S R， ?Schenker M B. J. Agr. Safety Health， ? 2002， ?8（2）： 199-214

4 Costa L G， ?Cole T B， ?Jarvik G P， ?Furlong C E. Annu. Rev. Med.， ? 2003， （54）： 371-392

5 GUO Nai-Fei， ?YU Ji-Cheng， ?JI Shu-Juan. Science and Technology of Food Industry， ? 2010， ?（3）： 409-413

郭乃菲， 于基成， 紀(jì)淑娟. 食品工業(yè)科技， ?2010， ?（3）： 409-413

6 CesarinoI， ?Moraes F C， ?Lanza M R V. Food Chem.， ? 2012， ?135（3）： 873-879

7 ProusalisK P， ?Polygenis D A， ?Syrokou A， ?Lamari F N， ?Tsegenidis T. Anal. Bioanal. Chem.， ? 2004， ?379（3）： 458-463

8 ZHANG Hui， ?HU Mei， ?WANG Jun， ?ZHANG Xi-Qi， ?ZHU Jian-Hua. Food Chem.， ? 2009， ?30（2）： 180-184

張 卉， 胡 梅， 王 俊， 張喜琦， 祝建華. 食品科學(xué)， ?2009， ?30（2）： 180-184

9 ZHU Li-Ping， ?ZHU Tao， ?PAN Yu-Xiang， ?SUN Jun， ?DONG Jing. Chinese J. Anal. Chem.， ? 2008， ?36（7）： 999-1003

朱莉萍， 朱 濤， 潘玉香， 孫 軍， 董 靜. 分析化學(xué)， ?2008， ?36（7）： 999-1003

10 Cerbera M I， ?Medina C， ?Portolés T， ?Pitarch E. Anal. Bioanal. Chem.， ? 2010， ?397（3）： 2873-2891

11 XIE Jian-Jun， ?CHEN Jie， ?LI Ju， ?YUAN Zhen-Yu， ?XIE Yu-Shan. Journal of Food Safety and Quality， ? 2013， ?4（1）： 82-88

謝建軍， 陳 捷， 李 菊， 袁震宇， 謝玉珊. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報， ?2013， ?4（1）： 82-88

12 CUI Shu-Hua， ?CHEN Wei-Shuang， ?QIAN Jia-Liang， ?DUAN Hao， ?LIU Tong-Ying， ?ZHANG Li-Dong. Chinese Journal of Chromatography， ? 2013， ?9（31）： 885-893

崔淑華， 陳慰雙， 錢家亮， 段 浩， 劉同英， 張立東. 色譜， ?2013， ?9（31）： 885-893

13 CAO Shu-Rui， ?LIU Zhi-Yong， ?ZHANG Lei， ?LI Xian-Liang， ?WANG Guo-Min， ?TANG Bo-Bin， ?YUAN Ruo. Chinese J. Anal. Chem. ， ? 2012， ?40（4）： 529-533endprint

曹淑瑞， 劉治勇， 張 雷， 李賢良， 王國民， 唐柏斌， 袁 若. 分析化學(xué)， ?2012， ?40（4）： 529-533

14 GBT 19648-2006， ?Method for Determination of 500 Pesticides and Related Chemicals Residues in Fruits and Vegetables-GC-MS Method. National Standards of the People′s Republic of China

水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留骨的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn).GBT 19648-2006

15 EN 165662-2008， ?Foods of Plant Origin-Determination of Pesticide Residues Using GC-MS and/or LC-MS/MS Following Acetonitrile Extraction/Partitioning and Cleanup by Dispersive SPE-QuEChERS-Method. EUROPEAN STANDARD

16 JIN Zhi， ?LI Ming， ?YANG Tao， ?ZHAHG Huang-Tao. Xinjiang Agricultural Science， ?2010， ?47（8）： 1693-1696

靳 智， 李 明， 楊 濤， 張煌濤. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， ?2010， ?47（8）： 1693-1696

Gas Chromatography-Mass Spectrometry Method for Rapid Detection

of 16 Preservative Residues in Vegetables for Export

ZHOU Xue1， CAO Shu-Rui2， LI Xian-Liang2， XI Cun-Xian2， XU Fen2， CHEN Zhi-Qiong*1

1（College of Pharmacy， Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）

2（Chongqing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Chongqing 400020， China）

Abstract A rapid detection method of 16 preservative residues in vegetables for export was developed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） after pre-treatment method of dispersive solid phase extraction （SPE）. Samples including leafy， eggplant fruit， bean， melon and tuber vegetables were extracted with acetonitrile and detected by GC/MS with external standard method after being cleaned up with dispersive SPE. The results showed that the method had a good linearity over concentration range of 0.02-2.0 mg/L preservatives with correlation coefficients of 0.9990-0.9997. The limits of detection （LODs） were in the range of 0.004-0.965 μg/kg. The recoveries of the preservatives were in the range of 76.7%-120.0% at the spiked levels of 0.01， 0.02 and 1.00 mg/kg， and the relative standard deviations （RSDs） were in the range of 2.1%-10.6%. Compared with the GB/T 19648-2006， etc， the method is rapid， simple， highly sensitive， and can meet testing requirements of 16 preservative residues in vegetables for export.

Keywords Dispersive solid phase extraction; Vegetables; Preservative; Gas chromatography-mass spectrometry

（Received 24 July 2014; accepted 24 September 2014）endprint