張偉豐，王 亮*，陳義勇

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830066；2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500)

阿魏菇多糖聚酰胺層析脫色工藝及其抑菌活性

張偉豐1，王 亮1*，陳義勇2

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830066；2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500)

[目的]探討阿魏菇多糖的聚酰胺層析脫色工藝及其抑菌活性。[方法]以新疆阿魏菇為原料，采用水浴浸提法提取阿魏菇多糖，以蛋白脫除率、多糖保留率和脫色率為指標(biāo)，探討聚酰胺用量、去離子水用量以及洗脫速度對阿魏菇多糖脫色的影響，并研究阿魏菇多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉和釀酒酵母的抑菌活性。[結(jié)果]聚酰胺層析法為阿魏菇多糖最佳的脫蛋白方法，其脫色最佳工藝條件為：聚酰胺用量為60 g(粗多糖的3000倍)，聚酰胺柱用1.5倍柱體積的去離子水以1.5 ml/min的流速進行洗脫，在此工藝條件下，蛋白質(zhì)脫除率達到93.6%。阿魏菇多糖對黑曲霉和釀酒酵母沒有抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用，最小抑菌濃度分別為3.125、6.250和3.125 mg/ml，且抑菌活性與多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系。[結(jié)論]聚酰胺層析工藝可用于阿魏菇多糖的脫色。

阿魏菇多糖；聚酰胺層析；脫色；抑菌

阿魏菇(Pleurotusferulae)又名阿魏側(cè)耳、阿魏蘑，因其生長在新疆干旱草原上的草本植物阿魏上而得名。其子實體具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值[1]。研究發(fā)現(xiàn)阿魏菇多糖具有增強免疫力[2]、抗炎[3]等功效。目前關(guān)于阿魏菇多糖的提取大多采用水浴醇沉法[4-5]，多糖提取物中含有較多的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)和色素，阿魏菇多糖的純化是其精制過程中非常重要的一步，是研究其理化性質(zhì)、生物活性和化學(xué)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。

為了獲得純度較高的阿魏菇多糖，筆者以新疆阿魏菇為原料，探討阿魏菇多糖的聚酰胺層析脫色工藝，另外關(guān)于阿魏菇多糖的抑菌活性研究尚未見報道，所以筆者在阿魏菇多糖純化的基礎(chǔ)上，進一步探討了其抑菌活性，旨在為開發(fā)阿魏菇多糖這一天然防腐劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑阿魏菇(購自烏魯木齊南山)，經(jīng)新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物教研室鑒定為阿魏菇子實體。粉末活性炭(成都科龍試劑公司)；樹脂S-8(天津南開大學(xué)化工廠)；聚酰胺(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司)；葡萄糖、苯酚、氯仿、正丁醇、三氯乙酸、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、95%乙醇等均為分析純。大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、黑曲霉(Aspergillusniger)由常熟理工學(xué)院微生物實驗室提供。細菌培養(yǎng)基、酵母培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基)和霉菌馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)參照文獻[6]配制。

1.2 主要儀器RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司)；DJ-04粉碎機(上海淀久中藥機械制造有限公司)；752型紫外-可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；LD4-ZA型離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；SHB-B循環(huán)水式真空泵(鄭州長城科工貿(mào)公司)；LGJ-10冷凍干燥儀(南京百思威科技有限公司)；UV2102 PCS紫外掃描儀(上海精密儀器有限公司)；DHP-90不銹鋼膽電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海索普機械有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1阿魏菇粉的制備。新鮮阿魏菇在50 ℃條件下真空干燥后粉碎，過80目篩，得到預(yù)處理的阿魏菇粉。

1.3.2阿魏菇多糖的提取。稱取阿魏菇粉5 g，放入250 ml的三角瓶中，加入200 ml水，在80 ℃條件下提取3 h，然后冷卻，將提取液離心(4 000 r/min，15 min)，棄去沉淀，將上清液減壓濃縮，按體積比1∶4加入95%乙醇，4℃條件下過夜，棄去上層液體，將沉淀冷凍干燥得到阿魏菇多糖。

1.3.3多糖含量測定。采用苯酚-硫酸法[7]。

1.3.4蛋白質(zhì)含量測定。采用福林-酚法[8]。

1.3.5阿魏菇多糖脫蛋白方法。

1.3.5.1三氯乙酸法。稱取20 mg阿魏菇多糖，加入蒸餾水配制成10%的多糖溶液，然后向多糖溶液加入三氯醋酸(3%)，直至溶液不再繼續(xù)渾濁為止，4 ℃條件下放置過夜，然后離心(1 000 r/min，15 min)，棄去沉淀，測定上清液中的蛋白質(zhì)和多糖含量，根據(jù)下列公式計算多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

(1)

(2)

1.3.5.2Sevage法。 稱取20 mg阿魏菇多糖，加入蒸餾水配制成10%的多糖溶液，按照阿魏菇多糖溶液的1/4體積加入Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)，在25 ℃下混合振蕩40 min，然后離心(1 000 r/min，15 min)去沉淀，將上清液再按上述比例加入Sevage試劑，重復(fù)操作5次，測定上清液中的蛋白質(zhì)含量和多糖含量，根據(jù)公式(1)和(2)計算多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

1.3.5.3聚酰胺層析法。稱取80 g聚酰胺，倒入一定量的去離子水加熱20 min，然后裝層析柱(4 cm×58 cm)，最后用去離子水洗脫平衡。稱取20 mg阿魏菇多糖，加入去離子水配制成10%的多糖溶液，將多糖溶液上柱，用去離子水洗脫，測定洗脫液中的蛋白質(zhì)含量和多糖含量，根據(jù)公式(1)和(2)計算多糖保留率和蛋白質(zhì)的脫除率。

1.3.6阿魏菇多糖聚酰胺層析脫色條件的優(yōu)化。

1.3.6.1聚酰胺用量對脫色效果的影響。 稱取20 mg阿魏菇多糖，加入去離子水配制成10%的多糖溶液，然后分別將20、40、60、80、100 g的聚酰胺倒入一定量的去離子水中加熱20 min，分別裝層析柱(4 cm×58 cm)，去離子水洗脫平衡。分別將多糖溶液加入聚酰胺層析柱中進行吸附，1倍柱體積的去離子水以1.0 ml/min的流速進行洗脫，359 nm處測定多糖原液和洗脫液吸光值，計算脫色率，根據(jù)公式(3)計算脫色率[9-10]，苯酚-硫酸法檢測多糖，根據(jù)公式(1)計算多糖保留率，探討聚酰胺用量對脫色效果的影響。

(3)

1.3.6.2去離子水用量對脫色效果的影響。稱取20 mg阿魏菇多糖，加入去離子水配制成10%的多糖溶液，然后添加到80 g的聚酰胺柱(40 cm×580 mm)中進行吸附，用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5倍柱體積的去離子水以1.0 ml/min的流速進行洗脫，分別計算脫色率和多糖保留率，探討去離子水用量對脫色效果的影響。

1.3.6.3洗脫速度對脫色效果的影響。稱取20 mg阿魏菇多糖，加入去離子水配制成10%的多糖溶液，然后添加到80 g的聚酰胺柱(40 cm×580 mm)中進行吸附，以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml/min的流速進行洗脫，分別計算脫色率和多糖保留率，探討洗脫速度對脫色效果的影響。

1.3.7紫外光譜檢測。稱取20 mg阿魏菇多糖，加入去離子水配制成10%的多糖溶液，在聚酰胺層析脫色最佳條件下，將阿魏菇多糖溶液上聚酰胺色譜柱，蒸餾水進行洗脫，紫外光譜對洗脫液進行掃描(波長范圍：190～800 nm)，探討聚酰胺層析對阿魏菇多糖蛋白質(zhì)的去除效果，根據(jù)公式(2)計算蛋白質(zhì)脫除率。

1.3.8阿魏菇多糖的抑菌活性。

1.3.8.1菌種活化與菌懸液制備[11]。將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌接種到細菌培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h；將黑曲霉和釀酒酵母分別接種到PDA培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)48 h，長出菌落后，分別挑取活化后的菌種放入9 ml無菌生理鹽水中，振蕩搖勻制備菌懸液，濃度約為107CFU/ml備用。

1.3.8.2抑菌試驗。用無菌水配制成質(zhì)量濃度為100 mg/ml的阿魏菇多糖溶液。分別稀釋成50.000、25.000、12.500、6.250、3.125 mg/ml系列質(zhì)量濃度溶液。取供試菌懸液0.1 ml(濃度約為107CFU/ml)置于倒好培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，放入牛津杯，向牛津杯中加入不同質(zhì)量濃度的多糖溶液150 μl，每個質(zhì)量濃度3次重復(fù)，同時用無菌水作對照。細菌于37℃培養(yǎng)48 h，真菌于28 ℃培養(yǎng)72 h，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑，出現(xiàn)抑菌圈所對應(yīng)的阿魏菇多糖濃度即為最小抑菌圈濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏菇多糖脫蛋白方法選擇三氯乙酸法、Sevage法和聚酰胺吸附柱層析法對阿魏菇多糖中的蛋白脫除效果見圖1。從圖1可以看出，三氯乙酸法蛋白脫除率和多糖保留率都較低，易引起多糖的降解。Sevage法脫除蛋白次數(shù)較多(6次)，導(dǎo)致多糖損失較多，聚酰胺吸附柱層析法具有較好的脫除蛋白效果，蛋白脫除率達90.8%，且對多糖影響較小，多糖保留率較高，達到88.6%，所以選擇聚酰胺吸附柱層析法作為阿魏菇多糖脫蛋白的方法。

2.2 阿魏菇多糖的脫色

2.2.1聚酰胺用量對脫色效果的影響。聚酰胺用量對阿魏菇多糖脫色效果的影響見圖2。從圖2可以看出，隨著聚酰胺用量的增加，脫色率逐步增大，多糖的保留率逐漸下降，當(dāng)聚酰胺用量超過60 g，多糖脫色率變化不大，但多糖的保留率有較大下降，為了盡可能多地保留多糖，節(jié)約處理費用，確定聚酰胺用量為60 g(粗多糖的3 000倍)。

2.2.2去離子水用量對脫色效果的影響。去離子水用量對脫色效果的影響見圖3。從圖3可以看出，隨著洗脫體積的增加，阿魏菇多糖脫色率逐步下降，但多糖保留率逐漸增加，當(dāng)洗脫體積達到1.5倍柱體積時，其脫色率達到51.2%，多糖保留率為88.2%，洗脫體積大于1.5倍柱體積時，多糖保留率變化不大，因此選用1.5倍柱體積的去離子水進行洗脫。

2.2.3洗脫速度對脫色效果的影響。洗脫速度對脫色效果的影響見圖4。從圖4可以看出，洗脫速度對脫色率沒有明顯影響，但隨著洗脫速度的增大，多糖的保留率逐漸減小，當(dāng)洗脫速度大于1.5 ml/min時，多糖的保留率變化不大。由于洗脫速度越小，耗時越長，所以選擇的洗脫速度為1.5 ml/min。

2.3 紫外光譜分析阿魏菇多糖脫蛋白前后的紫外光譜分別見圖5和圖6。從圖5和圖6可以看出，阿魏菇粗多糖在280 nm處有一個較為明顯的吸收峰，經(jīng)過聚酰胺色譜柱處理之后，這個峰消失，經(jīng)福林-酚法[7]測定后，蛋白質(zhì)脫除率達到93.6%。

2.4 阿魏菇多糖的抑菌活性阿魏菇多糖的抑菌效果見表1。從表1可以看出，阿魏菇多糖對黑曲霉和釀酒酵母沒有抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用，且抑菌活性與多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系，其中對金黃色葡萄球菌抑制作用最強，對大腸桿菌的抑制作用最弱。阿魏菇多糖對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度為3.125 mg/ml，對大腸桿菌的最小抑菌濃度為6.250 mg/ml。

3 結(jié)論

(1)該研究確定聚酰胺吸附柱層析法作為阿魏菇多糖脫蛋白的最佳方法。

(2)聚酰胺柱層析對阿魏菇多糖脫色的最佳工藝條件：聚酰胺用量為粗多糖的3 000倍，聚酰胺柱用1.5倍柱體積的去離子水以1.5 ml/min的流速進行洗脫，在此工藝條件下，蛋白質(zhì)脫除率達到93.6%。

(3)阿魏菇多糖對黑曲霉和釀酒酵母沒有抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用，且抑菌活性與多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系，其中對金黃色葡萄球菌抑制作用最強，對大腸桿菌的抑制作用最弱。阿魏菇多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度為3.125、6.250和3.125 mg/ml。

表1 阿魏菇多糖對各菌種的抑菌效果 mm

注：數(shù)據(jù)為抑菌圈直徑，數(shù)值為3次試驗的平均值，“-”表示未顯示抑菌活性。

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Decolorization Technology of Polysaccharides fromPleurotusferulaeby Polyamide Chromatography and Its Antibacterial Activity

ZHANG Wei-feng1, WANG Liang1*, CHEN Yi-yong2(1. School of Life Science and Technology, Xinjiang University,Urumqi, Xinjiang 830046;2.School of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology,Changshu, Jiangsu 215500)

[Objective] To investigate decolorization technology of polysaccharides fromPleurotusferulaeby polyamide chromatography and its antibacterial activity. [Method]Pleurotusferulaefrom Xinjiang was used as raw material. Polysaccharides fromPleurotusferulaewere extracted with water. Deprotein rate, polysaccharide retention rate and decoloration rate were used as the index. Effect of content of polyamide, deionized water and flow rate on decolorization of polysaccharides fromPleurotusferulaeby polyamide chromatography was investigated. Antibacterial activity against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae was also investigated. [Result] Polyamide chromatography was the best deproteinization method on polysaccharides fromPleurotusferulae. The optimum decolorization technology was as follows: The content of polyamide was 60 g, and the polyamide column was eluted with 1.5 column volumes of deionized water at flow rate of 1.5 ml/min. Under this technology, the deprotein rate was 93.6%. Polysaccharides fromPleurotusferulaehad no antimicrobial activity of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae and had antibacterial activities against Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Bacillus subtilis with minimum inhibitory concentration of 3.125, 6.250 and 3.125 mg/ml, respectively. The antibacterial activity was positively correlated with polysaccharides concentration. [Conclusion] Polyamide chromatography can be used for decolorization of polysaccharides fromPleurotusferulae.

Polysaccharides fromPleurotusferulae; Polyamide chromatography; Decolorization; Antibacterial

2013年新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項目計劃(指令性)項目(2013911071)。

張偉豐(1988- )，男，河南鄭州人，碩士研究生，研究方向：食品加工。*通訊作者，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事食品加工方面的研究。

2015-03-30

S 188

A

0517-6611(2015)14-033-03