朱海萍，李 彪，李 康，李會寧 (陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中 723001)

紫色薯蕷塊莖外植體組培快繁研究

朱海萍，李 彪，李 康，李會寧*(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中 723001)

[目的] 利用紫色薯蕷塊莖外植體開展組培快繁研究，篩選其最佳快繁條件。 [方法]以紫色薯蕷塊莖為外植體，于添加不同激素配比的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織、不定芽和不定根，探討植株再生與快繁條件。[結(jié)果] 適宜塊莖外植體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2～0.5 mg/L，誘導(dǎo)率達94.2%；叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1～0.2 mg/L+GA 1.0 mg/L，誘導(dǎo)率為89.7%；生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0～1.0 mg/L+GA 0～1.0 mg/L，生根率為91.1%；沙土移栽紫色薯蕷組培苗效果較好，成活率達94%。[結(jié)論]采用低濃度激素配比，獲得了紫色薯蕷塊莖外植體較高的誘導(dǎo)率和分化率；研究結(jié)果豐富了紫色薯蕷外植體離體無性系建立的研究資料，并可應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。

紫色薯蕷；組織培養(yǎng)；快繁

紫色薯蕷(DioscoreaalataL.′purple′)，又名紫山藥、紫蒔藥、紫淮山，是薯蕷科薯蕷屬草本蔓生性植物[1]，其作為綠色保健蔬菜逐漸在浙江、江蘇、福建、江西等地區(qū)推廣種植[2-3]。其薯形不一，薯皮褐色或紫褐色，薯肉多為亮麗的紫色。目前，關(guān)于紫山營養(yǎng)成分藥的研究較多[2-6]，紫山藥營養(yǎng)價值高[3]，含有多種礦質(zhì)元素、維生素和膽堿，富含薯蕷皂苷元[2-4]；紫山藥中的主要功能成分為多糖、薯蕷皂甙、尿囊素以及花青素等[2-3，5]。紫山藥是一種低脂肪、低熱量、高蛋白、高膳食纖維和礦物元素含量豐富的天然綠色食補健康食品，也是一味名副其實的具有滋補作用的上等藥材[2]；具有滋肺益腎、健脾止瀉、降壓利肝等作用[1，5]，可增加人體抵抗力，調(diào)節(jié)血壓、血糖，能抗衰益壽等，現(xiàn)已列入“抗癌中草藥大辭典”[5]。有關(guān)“薯蕷”資源的組織培養(yǎng)研究已有報道[7-16]，但關(guān)于紫色薯蕷的組培報道較少。韓曉勇等[4]利用“臺州紫山藥”開展了試管薯誘導(dǎo)體系的研究；王碧琴等[7-8]對紫山藥莖尖、莖段外植體培養(yǎng)及培養(yǎng)過程中的褐化問題進行探究。紫山藥的繁殖主要是通過塊莖繁殖和組培快繁[4]。筆者利用紫色薯蕷塊莖外植體開展組培快繁研究，篩選其最佳快繁條件，以促進紫山藥人工種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料供試材料于2011年11月采購于甘肅省蘭州市栽培的紫色薯蕷塊莖(圖1-1)。

1.2 方法

1.2.1外植體消毒。取紫色薯蕷塊莖，清洗表面后，自來水沖洗4～6 h；切去外圍組織，75%乙醇消毒25～30 s，無菌水沖洗1次，0.2%升汞消毒15～16 min，無菌水沖洗3～4次。

1.2.2愈傷組織誘導(dǎo)。將消毒后外植體切成約0.5 cm的小塊，每瓶接種1～2個外植體于初篩選的附加Na2S2O35.0 mg/L與6-BA(1.0、2.0 mg/L)、NAA(0.2、0.5 mg/L)和2，4-D 0.5 mg/L組合的MS基本培養(yǎng)基上，以確定愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.3增殖與分化培養(yǎng)。將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織分割成約0.5 cm的小塊，轉(zhuǎn)接到初篩選的附加Na2S2O35 .0mg/L與6-BA(1.0、2.0 mg/L)、NAA(0.1、0.2 mg/L)和GA 1.0 mg/L組合的MS基本培養(yǎng)基上，以確定增殖分化培養(yǎng)基。

1.2.4生根培養(yǎng)。將長至3～5枚幼葉的外植體，分別轉(zhuǎn)入初篩選的添加6-BA(0～1.0 mg/L)、NAA(0～0.5 mg/L)、IBA 0～0.5 mg/L與GA 0～1.0 mg/L組合的1/2MS培養(yǎng)基中，以確定生根培養(yǎng)基。

1.2.5練苗與移栽。當(dāng)根2～3條，苗高3 cm以上，綠葉1片以上即可移栽。移栽前，練苗2～3 d后，取出試管苗，洗去根上附著的培養(yǎng)基；將試管苗移栽到沙土或腐殖土的苗盤上；30 d后調(diào)查成活率。

1.2.6培養(yǎng)條件。以MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L，瓊脂條12.5 g/L，pH 5.8；培養(yǎng)溫度為25～28 ℃，相對濕度為60%～85%，光照強度為40 μmol/(m2·s)，輔助光照時間為12～14 h/d。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計統(tǒng)計每種培養(yǎng)基中愈傷組織形成的外植體數(shù)及誘導(dǎo)率，生芽的愈傷組織株數(shù)及誘導(dǎo)率，生根苗數(shù)和生根率等。愈傷誘導(dǎo)率=產(chǎn)愈傷組織外植體數(shù)/接種數(shù)×100%；不定芽誘導(dǎo)率=產(chǎn)芽愈傷組織塊數(shù)/接種數(shù)×100%；生根率=生根苗數(shù)/接種數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 防褐變處理試驗發(fā)現(xiàn)紫色薯蕷在組培過程中存在嚴(yán)重的褐變現(xiàn)象，紫色薯蕷組培苗或外植體枯死及其基部培養(yǎng)基黑褐化。此褐化現(xiàn)象又稱為酚污染，嚴(yán)重影響外植體的脫分化和培養(yǎng)物的再分化[10]。由此可知，材料消毒要根據(jù)外植體幼嫩程度適當(dāng)增減滅菌時間，對外植體進行連續(xù)轉(zhuǎn)移，在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的Na2S2O3可減輕褐變程度。

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)紫色薯蕷外植體經(jīng)處理后，接種于不同激素配比的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10 d后，部分外植體切口處有少量愈傷組織形成，表面淡紫色，其中MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上形成的愈傷組織較為明顯；20 d后，各培養(yǎng)基中的外植體均有不同程度的愈傷組織形成和增生；30 d后發(fā)現(xiàn)，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L和MS+6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L有利于愈傷組織誘導(dǎo)，形成的愈傷組織為1～2 mm的淡紫色小顆粒狀突起，其中6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L 培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率達94.2%(表1，圖1-2、3)。

表1 不同激素組合的 MS 培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 分化與增殖培養(yǎng)將紫色薯蕷塊莖外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織塊分割后，轉(zhuǎn)接于不同激素組合的增殖與分化培養(yǎng)基中，其中MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+GA 1.0 mg/L培養(yǎng)基有利于增殖和不定芽分化培養(yǎng)，誘導(dǎo)率達89.7%。培養(yǎng)10 d后，愈傷組織增生，顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色到深綠色，呈瘤狀愈傷組織群，表面有叢生芽原基分化；30 d后不定芽生長、增生，芽長0.5～1.5 cm，生長勢強；42 d后，芽苗產(chǎn)生1～3片幼葉，色淺綠，苗高1.0～3.0 cm，且長勢較好(表2，圖1-4、5)。

表2 不同激素配比的MS培養(yǎng)基對不定芽誘導(dǎo)的影響

2.4 生根培養(yǎng)將培養(yǎng)產(chǎn)生的叢生芽苗分割后，轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，各培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根有差異。1/2MS+IBA 0.5 mg/L+GA1.0 mg/L培養(yǎng)基易于誘導(dǎo)生根。10 d后，部分幼苗即有不定根產(chǎn)生；15 d后，多數(shù)幼苗產(chǎn)生不定根；20 d后，幼苗均產(chǎn)生不定根，且不定根數(shù)量增多，根數(shù)在8～15條；30 d后，誘導(dǎo)苗生根10～20條，根長2～5 cm，根系發(fā)達，植株長勢良好，其生根誘導(dǎo)率達91.1%。壯苗后轉(zhuǎn)接于1/2MS培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)表現(xiàn)良好，50 d后部分外植體上產(chǎn)生棒狀的小塊莖，直徑約2 mm，且隨著植株不斷增大，90 d后小塊莖直徑6～9 mm；150 d后，多數(shù)芽苗基部及莖節(jié)上產(chǎn)生直徑0.5～1.5 cm 零余子(表3，圖1-6～11)。

2.5 煉苗和移栽為提高成活率，先透氣煉苗后取出試管苗，用清水洗去根系上的培養(yǎng)基，置1 000倍KMnO4溶液中浸泡10 min后清水洗凈，將試管苗分別植入澆透水的沙土、腐殖土苗盤中，用塑料薄膜保濕，并控制相對濕度80%～85%，溫度25 ℃左右，噴水1～2次/d。以沙土為基質(zhì)的試管苗移栽15 d左右，移栽苗開始逐漸生長；30 d后成活率為94%，根多且粗白，莖葉生長旺盛，外觀性狀與母株一致；以腐殖土為基質(zhì)，試管苗移栽30 d后成活率為78.0%(圖1-12)。沙土移栽效果較好。

表3 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根培養(yǎng)結(jié)果

3 討論

在薯蕷外植體組織培養(yǎng)過程中，褐變是一個普遍而嚴(yán)重的問題。王碧琴等[7-8]報道了紫山藥組培中的褐變問題；謝碧霞等[11]報道盾葉薯蕷塊莖組織在培養(yǎng)基上會逐漸褐變，這種褐變狀況將維持50～60 d，在繼代培養(yǎng)也有褐變現(xiàn)象；穿龍薯蕷的愈傷組織培養(yǎng)過程中也出現(xiàn)嚴(yán)重的褐變現(xiàn)象[12]。褐變是由于外植體組織被切割和接種快繁時，損傷切面細(xì)胞中酚類物質(zhì)與酚氧化酶發(fā)生氧化反應(yīng)，形成有毒的醌類物質(zhì)；而紫色薯蕷細(xì)胞組織含有極高量的酚類物質(zhì)。外植體褐變，并擴散至培養(yǎng)基中，抑制其他酶活性，導(dǎo)致組織代謝紊亂，生長受抑制，最終致使外植體死亡[13-14]。影響組培過程中的褐變因素較多，如培養(yǎng)基成分、高濃度激素、外植體中所含的酚類物質(zhì)等，尤其是后者。在防褐變方面，不同研究者于培養(yǎng)基中添加AC或一定量的抗氧化劑VC，PVP，Cys，Na2S2O3等[7，13-14，17-18]，所產(chǎn)生的效果也表現(xiàn)出明顯的差異，但同時也對外植體生長產(chǎn)生影響。該試驗針對褐變，考察毒性和應(yīng)用性，在培養(yǎng)基中加入Na2S2O35.0 mg/L以抑制紫色薯蕷組培褐變，有一定的效果。

該試驗表明，不同類型和不同濃度的植物激素對紫色薯蕷塊莖外植體愈傷組織誘導(dǎo)效果存在差異。GA 在芽苗生長中的主要作用是促進莖的伸長生長[19]。適宜紫山藥塊莖愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽增殖和生根的培養(yǎng)基分別為 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1～ 0.2 mg/L+GA 1.0 mg/L和1/2MS+IBA 0～0.5 mg/L+GA 0～1.0 mg/L。該研究結(jié)果與梁艷麗等[9]、潘學(xué)峰等[10]、羅鳳霞等[12]、王軍等[15]、黃鳳翔等[16]的研究結(jié)果相比，其外植體類型、激素種類和濃度有一定差異。薯蕷相關(guān)的組培研究較多，但該研究采用低濃度激素配比，獲得了紫山藥塊莖外植體較高的誘導(dǎo)率、分化率和部分小塊莖的產(chǎn)生，同時也補充了外植體的類型。研究結(jié)果可豐富紫山藥外植體離體培養(yǎng)無性系建立的研究資料，并可應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。

隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強，目前市場對紫色薯蕷的需求不斷增長。但紫色薯蕷的人工栽培技術(shù)還未被廣泛推廣，良種繁育和種苗源匱乏是制約紫色薯蕷資源利用的瓶頸。該研究結(jié)果提供了一種簡單、實用的紫色薯蕷試管快速繁殖技術(shù)，有助于其人工種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

[1] 趙冬蘭，唐君，劉靖，等.紫山藥的引種與標(biāo)準(zhǔn)化栽培技術(shù)初探[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21(2)：78-79.

[2] 劉影，史姍姍，汪財生.浙江紫山藥營養(yǎng)成分及薯蕷皂苷元含量測定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(9)：4563-4564，4567.

[3] 宋曙輝，劉龐源，王文琪，等.不同產(chǎn)地紫山藥營養(yǎng)和功能成分分析[J].營養(yǎng)學(xué)報，2012，34(1)：92-93，96.

[4] 韓曉勇，閆瑞霞，殷劍美，等.‘臺州紫山藥’試管薯誘導(dǎo)體系研究[J].園藝學(xué)報，2013，40(10)：1999-2005.

[5] 倪勤學(xué)，高前欣，霍艷榮，等.紫山藥色素的提取工藝及抗氧化性能研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24(2)：229-233.

[6] 于東，林躍偉，陳桂星，等.紫山藥營養(yǎng)成分分析研究[J].營養(yǎng)學(xué)報，2010，32(2)：190-192.

[7] 王碧琴，朱祺，劉騰云，等.紫山藥組織培養(yǎng)及褐化因素的研究[J].江西科學(xué)，2014，32(1)：43-44.

[8] 王碧琴，周華，朱祺，等.紫山藥組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(11)：48-50.

[9] 梁艷麗，趙慶云，謝世清.盾葉薯蕷組培快繁技術(shù)研究[J].長江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010(2)：10-12.

[10] 潘學(xué)峰，王小精.墨西哥菊葉薯蕷離體快繁技術(shù)研究[J].海南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，25(2)：163-168.

[11] 謝碧霞，何業(yè)華，易志軍.盾葉薯蕷愈傷組織培養(yǎng)及其高產(chǎn)系的篩選[J].中南林學(xué)院學(xué)報，1999，19(4)：18-20.

[12] 羅鳳霞，祝朋芳，周廣柱，等.穿龍薯蕷的組織培養(yǎng)研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，35(1)：4-6.

[13] 蔡建榮.山藥莖段愈傷組織褐變與外源藥物抑制效應(yīng)的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(5)：523-525.

[14] MAYER A M.Polyphenol oxidase in plants-resent progress [J].Phytochemistry，1987，26：11- 20.

[15] 王軍，張金蓮，李少峰，等.盾葉薯蕷組培誘導(dǎo)分化實驗研究[J].云南農(nóng)業(yè)科技，2006(3)：23-24.

[16] 黃鳳翔，管艷，梁國平，等.不同植物激素用量對菊葉薯蕷組織培養(yǎng)的影響[J].熱帶農(nóng)業(yè)科技，2007，30(2)：21-23.

[17] 何瓊英.抗壞血酸預(yù)處理防止香蕉吸芽外植體褐變的研究初報[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995，16(3)：79-82.

[18] 張蓉，李向民.菊葉薯蕷組培快繁中常見的幾個問題及對策[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(3)：89-91.

[19] 李保珠，趙翔，安國勇.赤霉素的研究進展[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27(1)：1-5.

Study on Rapid Propagation of Purple yaminvitro

ZHU Hai-ping, LI Biao, LI Kang, LI Hui-ning*

(School of Biological Sciences and Engineering, Shaanxi University of Technology,Shaanxi Province Key Laboratory of Bio-resources, Hanzhong, Shaanxi 723001)

[Objective] The better rapid propagation conditions were screened using purple yam as explants. [Method] The callus, adventitious bud and root were induced on MS medium with different hormones using tubers of purple yam(DioscoreaalataL. ′purple′) as explants, and the conditions of proliferation culture and plant regeneration were discussed. [Result]The results showed the suitable medium for callus induction was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2-0.5 mg/L, and the induction rate was 94.2%; the suitable medium for buds induction was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1-0.2 mg/L+GA 1.0 mg/L, and the induction rate reached 89.7%; rooting induction was easy on 1/2MS+IBA 0-1.0 mg/L+GA 0-1.0 mg/L and rooting rate up to 91.1%; sandy soil was more suitable for transplanting yam, and the survival rate reached 94%. [Conclusion] This test got the higher induction rate and differentiation rate for purple yam tuber explant, using low concentration ratio of hormones. This result provided a simple and practical technology for purple yam in virto, helping to promote the artificial planting industry.

DioscoreaalataL. ‘purple’;Tissue culture; Rapid propagation

陜西省教育廳基金項目(12JS026)。

朱海萍(1988- )，女，山東菏澤人，碩士研究生，研究方向：植物生物技術(shù)。*通訊作者，高級實驗師，從事植物生物技術(shù)研究。

2015-03-30

S 632.1044.3

A

0517-6611(2015)14-022-03