李秦晉， 魏寶陽 (.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 4028；2.湖南體育職業(yè)學(xué)院，湖南長沙 4009)

Cry1Ab蛋白對(duì)擬環(huán)紋豹蛛生長發(fā)育的影響

李秦晉1,2， 魏寶陽1(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.湖南體育職業(yè)學(xué)院，湖南長沙 410019)

[目的] 探明Cry1Ab蛋白通過培養(yǎng)基-果蠅-擬環(huán)紋豹蛛這一食物鏈的傳遞，最終在擬環(huán)紋豹蛛(Pardosapseudoannulata)體內(nèi)的富集情況以及毒蛋白隨食物鏈的傳遞在各營養(yǎng)級(jí)中的變化規(guī)律。[方法]采用酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)測(cè)定Cry1Ab蛋白在擬環(huán)紋豹蛛和果蠅中的含量。[結(jié)果]Cry1Ab蛋白對(duì)不同齡期擬環(huán)紋豹蛛的體長、背甲寬、中眼域?qū)?、腿長等生長指標(biāo)不存在顯著性差異，但對(duì)體重產(chǎn)生一定的影響，使得其體重略有下降的趨勢(shì)。在0～10 d Cry1Ab蛋白在擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)不斷累積，但10 d后擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)Cry1Ab蛋白含量逐漸降低。[結(jié)論] Cry1Ab蛋白在擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)具有富集效應(yīng)。

擬環(huán)紋豹蛛；果蠅；Cry1Ab蛋白；食物鏈

盡管轉(zhuǎn)基因抗蟲作物可以帶來巨大效益[1-2]，但關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)安全性評(píng)價(jià)受到了世界各國政府部門和科技人員的重視，許多學(xué)者對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的利弊及其潛在的生態(tài)環(huán)境問題進(jìn)行了分析[3-8]。其中抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因作物對(duì)害蟲天敵等非靶標(biāo)昆蟲的潛在影響是當(dāng)今轉(zhuǎn)基因生物安全性的研究熱點(diǎn)之一[9-13]。

擬環(huán)紋豹蛛(Pardosapseudoannulata)是稻田蜘蛛中的優(yōu)勢(shì)種群[14]，農(nóng)田作物害蟲最主要的捕食性天敵之一[15-22]。作為害蟲的重要捕食性天敵，Bt蛋白會(huì)隨水稻-害蟲-蜘蛛這一食物鏈傳遞，水稻中的Bt毒蛋白有可能會(huì)在蜘蛛體內(nèi)積累，對(duì)其繁殖、生長和發(fā)育產(chǎn)生潛在影響。鑒于此，筆者模擬水稻食物鏈，構(gòu)建實(shí)驗(yàn)室Bt培養(yǎng)基-果蠅-蜘蛛這一食物鏈，以此探明Bt毒蛋白沿食物鏈的傳遞對(duì)蜘蛛毒害的生態(tài)效應(yīng)，明確這種效應(yīng)對(duì)蜘蛛生長、發(fā)育和繁殖的影響，同時(shí)也為Bt作物生態(tài)安全性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料在田間采集擬環(huán)紋豹蛛帶回室內(nèi)飼養(yǎng)備用。

1.2 主要試劑Cry1Ab蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(上海佑隆生物科技有限公司)，EnviroLogix Cry1Ab/Cry1Ac(ELISA)蛋白檢測(cè)試劑盒(上海佑隆生物科技有限公司)，SOD、GSH-Px試劑盒(南京建成生物工程研究所)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器電熱恒溫水浴鍋(DK-98-IIA)，天津市泰斯特儀器有限公司；可見分光光度計(jì)(V-5000型)，上海元析儀器有限公司；臺(tái)式低溫冷凍離心機(jī)，日本日立儀器有限公司；酶標(biāo)儀(MK3型)，熱電(上海)儀器有限公司；電子分析天平(TMP-510)，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(LRH-250-S)，廣東省醫(yī)療器械廠。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1擬環(huán)紋豹蛛的喂養(yǎng)。在同一非Bt水稻田塊采集帶有卵囊的擬環(huán)紋豹蛛，待卵囊孵化5 d后，將幼蛛接入2.5 cm的大型試管內(nèi)(保證試驗(yàn)蜘蛛均來自同一卵囊)，每管一頭，進(jìn)行單頭飼養(yǎng)，每支試管中均置一團(tuán)濕潤的脫脂棉，并每天加水3～4滴于脫脂棉上，為其提供水分。試驗(yàn)組為每天喂食在含有Cry1Ab蛋白培養(yǎng)基上飼養(yǎng)5～10 d的果蠅，正常組為每天喂食在普通培養(yǎng)基上飼養(yǎng)5～10 d的果蠅。

每只幼蛛蛻皮后2 d，對(duì)其進(jìn)行稱重，并從中取出2只幼蛛用75%的乙醇浸泡2h后進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.4.2Cry1Ab蛋白的提取。分別將試驗(yàn)組和正常組的擬環(huán)紋豹蛛麻醉，每組取3只擬環(huán)紋豹蛛，將其麻醉后稱重，待其將要蘇醒時(shí)立即置于勻漿器中，加入250 μl提取液，在冰浴中將擬環(huán)紋豹蛛研磨成勻漿。將勻漿后的樣品液于高速冷凍離心機(jī)中以4 000 r/min(4 ℃)離心10 min，取上清液用于ELISA檢測(cè)Cry1Ab蛋白含量，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3Cry1Ab蛋白含量測(cè)定(ELISA)。

1.4.3.1Cry1Ab蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。取標(biāo)準(zhǔn)CrylAb蛋白用樣品提取緩沖液依次稀釋成1、2、4、6、8 ng 5個(gè)梯度，按照試劑盒說明的方法進(jìn)行測(cè)定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3.2酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)。取5 μl待測(cè)樣品，加入45 μl提取液，將待測(cè)樣品稀釋10倍，在微孔板的每孔中加入50 μl酶標(biāo)記Cry1Ab/Cry1Ac后，立刻加入50 μl空白對(duì)照(提取液)、陽性對(duì)照和樣品稀釋液，輕搖混勻20～30 s；微孔板上加蓋防止液體蒸發(fā)，室溫下溫育2 h后小心地揭去蓋，搖勻微孔內(nèi)液體，并加入洗滌緩沖液沖洗，用力棄去微孔中的液體，重復(fù)3次；接著在每孔中加入300 μl洗滌液洗滌，并在紗布上拍干，每孔中加入100 μl底物溶液，輕搖混勻20～30 s，微孔板上加蓋，室溫下溫育15～30 min，每孔中加入100 μl 終止液，充分混勻后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下讀取OD值，用測(cè)試孔OD-空白孔OD，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到Cry1Ab蛋白的含量(ng)，將結(jié)果換算成可溶性蛋白中含有的Cry1Ab蛋白量(ng/mg)。

1.5 數(shù)據(jù)分析采用WPS Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理 ,并用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長指標(biāo)由表1可知，Bt蛋白對(duì)不同齡期擬環(huán)紋豹蛛的體長、中眼域?qū)捄捅臣讓挼壬L指標(biāo)不存在顯著性差異。

表1 不同齡期擬環(huán)紋豹蛛生長指標(biāo) cm

2.2 重量由表2可知，Bt蛋白對(duì)不同齡期擬環(huán)紋豹蛛的重量有一定影響，使得其體重略有下降趨勢(shì)。在5齡時(shí)，體重的差異性最大(4齡、5齡存在顯著性差異)。

表2 不同齡期擬環(huán)紋豹蛛重量 mg

2.3 蛋白含量由表3可知，在0～10 d Cry1Ab蛋白在果蠅體內(nèi)的含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而不斷增加，表明Cry1Ab蛋白的確在果蠅體內(nèi)有富集作用，但在10 d后Cry1Ab蛋白含量下降，但在15 d時(shí)含量仍高于對(duì)照。 由表4可知，第1～7天Cry1Ab蛋白在擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)均具富集作用(P<0.05)，到第7天時(shí)達(dá)到最高值，達(dá)極顯著差異(P<0.01)，然后逐漸降低，但仍顯著高于對(duì)照(P<0.05)。

表3 不同培養(yǎng)時(shí)間果蠅體內(nèi)Cry1Ab蛋白含量

表4 不同齡期擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)Cry1Ab蛋白含量

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

有關(guān)抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因作物對(duì)其非靶標(biāo)植食者及天敵的正面或負(fù)面影響已有較多報(bào)道[2,23-25]，但僅分析了溫室或田間條件下轉(zhuǎn)基因作物對(duì)供試對(duì)象生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性的影響，而極少探討B(tài)t殺蟲蛋白能否在轉(zhuǎn)基因植物-非靶標(biāo)植食者-天敵三者間進(jìn)行轉(zhuǎn)移與富集。該試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基中的CrylAb毒蛋白在果蠅體內(nèi)的積累作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)CrylAb毒蛋白在果蠅體內(nèi)的含量隨取食時(shí)間的延長先增加后下降。而喂食含有CrylAb毒蛋白果蠅的擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)CrylAb毒蛋白也呈先增加后下降的趨勢(shì)。CrylAb毒蛋白能夠在果蠅及擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)產(chǎn)生富集效應(yīng)，而后蛋白含量下降，可能是由于隨取食時(shí)間的延長，CrylAb毒蛋白對(duì)果蠅和擬環(huán)紋豹蛛造成了影響，使個(gè)體生活力下降，取食量下降，攝入的CrylAb毒蛋白較少所致；也可能是由于培養(yǎng)基中的CrylAb蛋白已耗盡，而果蠅體內(nèi)的CrylAb毒蛋白被降解而造成。目前的研究是在較短時(shí)間內(nèi)得出的，長期作用結(jié)果如何，以及具體機(jī)理尚有待進(jìn)一步跟蹤研究。

該試驗(yàn)以Bt非靶標(biāo)生物果蠅作為蜘蛛的食物來源，探討B(tài)t毒素在Bt培養(yǎng)基-果蠅-蜘蛛這一食物鏈中的傳遞和累積規(guī)律，以及Bt蛋白的富集對(duì)蜘蛛生長發(fā)育的影響，可在一定程度上揭示轉(zhuǎn)Bt蛋白對(duì)稻田蜘蛛長期安全性的影響。其次，通過同一母體的幼蛛在Bt毒蛋白脅迫下對(duì)其生長發(fā)育影響，最大可能地消除蜘蛛個(gè)體間的差異，使得試驗(yàn)更具參考意義

[1] HILDER V A,BOULTER D.Genetic engineering of crop plants for insect resistance-a critical review[J].Crop Prot,1999,18:177-191.

[2] SHELTON A M,ZHAO J Z,ROUSH R T.Economic,ecologic,food safety,and social consequences of the development of Bt transgenic plants[J].Ann Rev Entomol,2002,47:845-881.

[3] 修偉明,劉紅梅,李剛,等.轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米發(fā)展?fàn)顩r及對(duì)非靶標(biāo)昆蟲的影響[J].玉米科學(xué),2009,17(4):1-6.

[4] WOLFENBARGER L L,NARANJO S E,LUNDGREN,J G,et al.Bt crop effects on functional guilds of non-target arthropods:a meta- analysis[J].PLoS One,2008,3(5):2118.

[5] 錢迎倩,魏偉,桑衛(wèi)國,等.轉(zhuǎn)基因作物對(duì)生物多樣性的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2001,21(3):337-343.

[6] 史曉利,楊益眾,蔡建華,等.Bt毒蛋白在轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米中的表達(dá)及在亞洲玉米螟中的轉(zhuǎn)移積累[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2009,20(11):2773-2777.

[7] CHEN M,ZHAO J Z,YE G Y,et al.Impact of insect-resistant transgenic rice on target insect pests and non-target arthropods in China[J].Insect Science,2006,13:409-420.

[8] CHEN M,SHELTONH A,YE G Y.Insect-resistant genetically modified rice in China:from research to commercialization[J].Annual Review of Entomology,2011,56:81-101.

[9] POPPY G M.Corps:environmental risks and non-target effects[J].Trends Plant Sci,2000,5:4-6.

[10] 李麗莉,王振營,何康來,等.轉(zhuǎn)基因抗蟲作物對(duì)非靶標(biāo)昆蟲的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2004,24(8):1797-1806.

[11] ROMEIS J,MEISSLE M,BIGLER F.Transgenic crops expressing Bacillus thuringiensis toxins and biological control[J].Nat Biotechnol,2006,24:63-71.

[12] MARVER M,MCCREEDY C,REGETZ,et al.A meta-analysis of effects of Bt cotton and maize on non-target invertebrates[J].Science,2007,316:1475-1477.

[13] SHELTON A M,SEARS M K.The monarch butterfly controversy:scientific interpretations of a phenomenon[J].The Plant Journal,2001,27(6):483-488.

[14] ANDREA CHIPMAN.Fears over Europe’s GM crop plan[J].Nature,2010,466:542-543.

[15] 劉雨芳,古德祥,張古忍.廣東省稻田生態(tài)系統(tǒng)中蜘蛛群落多樣性研究[J].蛛形學(xué)報(bào),2003,12(1):27-31.

[16] 孫繼英,彭光旭,胡波,等.擬環(huán)紋豹蛛種群遺傳多樣性與其生境的關(guān)系[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2007,18(5):1081-1085.

[17] 田俊策,陳洋,李兆亮,等.轉(zhuǎn)cry1Ab基因水稻和兩種殺蟲劑對(duì)非靶標(biāo)天敵擬環(huán)紋豹蛛免疫影響的評(píng)價(jià)[J].中國生物防治學(xué)報(bào),2011,27(4):559-563.

[18] 王洪全.稻田蜘蛛利用研究[M].北京:科技文獻(xiàn)出版社,1981:1-28.

[19] 宋大祥.中國農(nóng)田蜘蛛[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1987:376.

[20] RIECHERT S E,BISHOP L.Pery control by an assemblage of generalist predators:Spiders in garden test systems[J].Ecology,1992,71:1441-1450.

[21] BARRION A T,LITSINGER J A.Riceland of South and South east Asia[M].Wallingford,UK：CAB International,1995：701.

[22] 王智.擬環(huán)紋豹蛛的生物生態(tài)學(xué)研究[J].昆蟲學(xué)報(bào),2007,50(9):927-932.

[23] HIGH S M,COHEN M B,SHU Q Y,et al.Achieving successful deployment of Bt rice[J].Trends Plant Sci,2004,6:286-292.

[24] O’CALLAHGANA M,GLAREl T R,BURGESS E P J,et al.Effects of Plnats genetically modified of insect resistance on non-target organisms[J].Annu Rev Entomol,2005,50:271-292.

[25] 劉志誠,葉恭銀,傅強(qiáng),等.轉(zhuǎn)Cry1Ab基因水稻對(duì)擬水狼蛛捕食作用間接影響的評(píng)價(jià)[J].中國水稻科學(xué),2003,27(2):175-178.

Effect of Cry1Ab Protein on Growth ofPardosepseudoannulata

LI Qin-jin1,2,WEI Bao-yang1(1.College of Bioscience & Biotechnology,Hunan Agriculture University,Changsha,Hunan 410128;2.Hunan Sports Vocational College,Changsha,Hunan 410019)

[Objective] The aim was to prove food chain transfer of Cry1Ab protein through the medium-fruit flies and intends toP.pseudoannulata, the final accumulate inP.pseudoannulatabody as well as toxic protein variation in each trophic level with the transfer of the food chain.[Method]Using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) the content of Cry1Ab protein in theP.pseudoannulataandDrosophilamelanogasterwas determined.[Result]The results showed that,there was no signifant difference that Cry1Ab protein on body length,carapace width,the width of the eye domain,legs and other growth indicators ofP.pseudoannulatain different ages,but had a certain impact on body weight,so its weight was slightly a downward trend.Cry1Ab protein within 0-10 d accumulated inP.pseudoannulatabody,but after 10 days Cry1Ab protein content intended to decrease.[Conclusion] The study had shown the Cry1Ab protein enrichment effect ofP.pseudoannulatabody.

Pardosapseudoannulata;Drosophilamelanogaster; Cry1Ab protein; Food chain

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31472017)；湖南省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2014FJ2003)。

李秦晉(1975- )，男，湖南益陽人，講師，在讀博士，從事農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)研究。

2015-03-31

S 188

A

0517-6611(2015)14-013-03