■楊春蕾 黃晶晶 李 琳 張建斌 洪中山 焦小麗 周文忠 郭 亮

(1.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100094)

動(dòng)物納米生物學(xué)的研究，主要進(jìn)展是在制備高 效、低濃度的藥物用于動(dòng)物疾病的預(yù)防、診斷和治療方面。許多藥物在臨床應(yīng)用時(shí)發(fā)揮了良好的治療作用，但有的藥物由于自身的化學(xué)和生物特性，使其不能發(fā)揮應(yīng)有的生物治療效應(yīng)。目前伴隨著納米材料學(xué)、納米化學(xué)、納米物理學(xué)、納米電子學(xué)、納米顯微學(xué)、納米機(jī)械學(xué)和納米加工技術(shù)的發(fā)展，為動(dòng)物納米生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展奠定了科學(xué)理論和方法學(xué)基礎(chǔ)(Xiaowei Ma，2010；張陽德等，2001；秦翠云等，2001)。納米技術(shù)能夠?qū)㈩w粒藥物轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的納米粒子，從而有效提高藥物的生物利用度（He W，2011；Gref R，1994；Keahler T.1994）。利用納米藥物可以靶向運(yùn)輸?shù)教囟ò邢蛭稽c(diǎn)，發(fā)揮藥物生物利用率、減少藥物用量、降低負(fù)面效應(yīng)，從而消除對(duì)動(dòng)物組織器官的蓄積毒性(Shuyu Xie，2011；Shafiq S，2007)。本試驗(yàn)選用恩諾沙星納米乳制劑由恩諾沙星和十六烷基脂肪酸組成。通過不同濃度恩諾沙星納米乳，測(cè)定生長仔豬的抗氧化性能，為評(píng)定納米制劑工藝的藥理藥效提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

健康免疫的生長仔豬5頭，品種長白豬（杜×大×長）和大約克夏豬（杜×長×大）三元商品豬。平均體重（16.16±1.44）kg。試驗(yàn)場地，天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)場。

1.2 試驗(yàn)材料

恩諾沙星納米乳：由十六烷基棕櫚酸和恩諾沙星合成的納米粒藥物。納米工藝合成由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)周文忠教授實(shí)驗(yàn)室完成。納米藥物中恩諾沙星粉劑含量5.0 mg/ml。理化性能：納米粒度實(shí)測(cè)平均粒徑為（111.0±7.2）nm，分散指數(shù)為0.26±0.17，電動(dòng)勢(shì)為（-31.57±3.76）mv。

1.3 試驗(yàn)日糧

試驗(yàn)日糧參照動(dòng)物營養(yǎng)參數(shù)與飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和美國NRC豬的營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用優(yōu)化畜禽飼料配方系統(tǒng)配制的全價(jià)配合飼料。

1.4 試驗(yàn)設(shè)備

試驗(yàn)豬籠：仔豬消化代謝試驗(yàn)豬籠，長×高×寬=1.4 m×0.5 m×0.65 m，根據(jù)試驗(yàn)豬的生長階段調(diào)節(jié)飼養(yǎng)籠內(nèi)的空間大小?？烧{(diào)控式代謝試驗(yàn)籠放置實(shí)驗(yàn)舍內(nèi)適宜的位置，通風(fēng)、采光和衛(wèi)生良好。

測(cè)定試劑盒：丙二醛（MDA）、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GSH-ST）測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

5810R冷凍型臺(tái)式大容量高速離心機(jī)：德國Eppendorf公司。

T6紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用有限責(zé)任公司。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)豬舍消毒程序：首要，門窗打開通風(fēng)，清掃墻壁地面棚頂，沖洗豬籠和使用器具及屋舍地面。再次清洗屋舍和試驗(yàn)器具。之后，風(fēng)干后屋舍門窗封閉，進(jìn)行藥物熏蒸消毒24 h。最后，消毒液噴灑消毒屋舍內(nèi)使用器具和活動(dòng)空間。

試驗(yàn)隨機(jī)選擇健康仔豬5組，按生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)程拉丁方設(shè)計(jì)(5×5)。其中分為4個(gè)試驗(yàn)處理組，1個(gè)空白對(duì)照組，每組1頭仔豬。試驗(yàn)分別設(shè)正式給藥試驗(yàn)期7 d和無藥恢復(fù)適應(yīng)期7 d。恩諾沙星納米乳分別按0、5.0、2.5 mg/kg和1.5 mg/kg劑量，采食之前對(duì)仔豬進(jìn)行口服給藥，在給藥后0、6、24 h和48 h時(shí)間分別前腔靜脈采血。試驗(yàn)正試期開始空腹稱重并做記錄，每天定時(shí)飼喂全價(jià)飼料2次（8：00AM和16：00PM），仔豬自由采食、飲水，保持舍內(nèi)清潔。

1.5.2 測(cè)定指標(biāo)

1.5.2.1 臨床癥狀觀察

每日觀察各試驗(yàn)處理組仔豬的精神狀態(tài)、記錄日采食量等狀況。

1.5.2.2 指標(biāo)檢測(cè)

仔豬于試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)空腹稱重，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)仔豬前腔靜脈采血5 ml，3 000 r/min離心15 min分離血清，置于Eppendorf管中，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)丙二醛（MDA）和谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GSTST）含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行處理，并做單因素方差分析，采用鄧肯氏法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 臨床癥狀觀察

試驗(yàn)期間對(duì)照組和試驗(yàn)組仔豬的精神活動(dòng)、飲食和對(duì)外界的反應(yīng)能力均正常狀態(tài)。試驗(yàn)各階段的生長性能，平均日采食量、日增重和料重比結(jié)果均在正常范圍。試驗(yàn)過程也監(jiān)測(cè)到不同劑量恩諾沙星納米乳對(duì)仔豬生化指標(biāo)的影響。如恩諾沙星納米乳對(duì)仔豬肝臟ALT和AST的影響，對(duì)仔豬腎臟Crea和Urea的影響，均未出現(xiàn)異常。

2.2 恩諾沙星納米乳對(duì)生長仔豬GSH-ST的影響

GSH-ST試驗(yàn)結(jié)果見表1，分別按0、1.5、2.5 mg/kg和5.0 mg/kg劑量對(duì)仔豬口服給藥后，在機(jī)體內(nèi)經(jīng)血液6 h循環(huán)代謝，GSH-ST是多種生理功能的蛋白質(zhì)，其主要存在于細(xì)胞液中，6 h的谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶的活性檢測(cè)值范圍在(25.29±5.34)～(39.52±18.41)mg/l。隨著藥物濃度的增加，谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶也在增加趨勢(shì)，不同劑量組間的GSH-ST差異不顯著（P＞0.05）；納米粒藥物為5.0 mg/kg時(shí)，GSH-ST達(dá)到了最高值為(39.52±18.41)mg/l。

給藥24 h時(shí)間采血，藥物納米粒的各濃度在仔豬體內(nèi)的 GSH-ST 檢測(cè)值為(25.29±5.34)～(52.12±20.89)mg/l。不同劑量組間的GSH-ST出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）；給藥劑量5.0 mg/kg時(shí)，GSH-ST達(dá)到了顯著值為(52.12±20.89)mg/l。GSH-ST具有清除過氧化物和解毒的功能，GSH-ST的值增加，可以保護(hù)組織細(xì)胞免受氧化損傷。其也是肝臟損傷的敏感指標(biāo)，肝細(xì)胞受損傷時(shí)，肝細(xì)胞合成的GSH-ST含量明顯減少（孫麗萍，2008）。納米粒能夠防止脂質(zhì)的過氧化損傷(Shuyu Xie，2011)，這與本研究結(jié)論具有一致性（楊春蕾，2012）。給藥48 h時(shí)間，藥物納米粒的各濃度在仔豬體內(nèi)的GSH-ST檢測(cè)值有顯著性差異（P＜0.05）；呈明顯上升趨勢(shì)。本研究的先前試驗(yàn)結(jié)果，恩諾沙星納米乳對(duì)仔豬肝臟ALT和AST的影響（楊春蕾，2012），對(duì)仔豬腎臟Crea和Urea的影響。說明GSH-ST的增加，為維護(hù)各器官的正常功能，通過分子間巰基的轉(zhuǎn)換，積極發(fā)揮著組織細(xì)胞抗氧化作用和潛在的修復(fù)性能，其分子機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

表1 恩諾沙星納米乳對(duì)仔豬GSH-ST的影響(mg/l)

2.3 恩諾沙星納米乳對(duì)生長仔豬MDA的影響(見表2)

表2 恩諾沙星納米乳對(duì)仔豬MDA的影響（nmol/ml）

由表2可見，口服6 h劑量0、1.5、2.5 mg/kg和5.0 mg/kg恩諾沙星納米乳，測(cè)定值為(2.50±0.85)～(3.38±1.82)nmol/ml。隨著藥物濃度的增加，有增加趨勢(shì)，但不同劑量間的MDA差異不顯著（P＞0.05）。評(píng)定機(jī)體的脂質(zhì)過氧化程度(郭藝璇，2015；冉茂良等，2013)，本試驗(yàn)在給藥6 h，劑量5.0 mg/kg時(shí)，該值達(dá)到了較高。其后本試驗(yàn)的氧自由基的生成和細(xì)胞膜被氧化的程度，參照前者研究文獻(xiàn)（王巧莉等，2009）。給藥24 h和48 h，納米粒藥物的各濃度分別使機(jī)體內(nèi)的MDA未出現(xiàn)顯著差異（P＞0.05）。說明試驗(yàn)檢測(cè)的MDA指標(biāo)所反映的細(xì)胞損傷程度差異不明顯。

本試驗(yàn)斷奶仔豬口服不同劑量的恩諾沙星納米乳，采血檢測(cè)不同時(shí)間的MDA含量與對(duì)照組差異不顯著，說明恩諾沙星納米乳沒有對(duì)斷奶仔豬造成細(xì)胞損傷。

3 結(jié)論

評(píng)定恩諾沙星納米乳影響斷奶仔豬抗氧化性能試驗(yàn)，口服的藥物可以提高機(jī)體內(nèi)的谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶水平，起到細(xì)胞抗氧化的作用?？寡趸笜?biāo)丙二醛顯示，十六烷基組合的納米粒給藥濃度和方式，沒有對(duì)生長仔豬組織細(xì)胞造成異常影響。恩諾沙星納米乳，對(duì)生長仔豬有抗氧化性能，可為臨床應(yīng)用提供參考。