■韓佳慧 郭云霞 李 曄 徐大慶 吳國江 郝慶紅 魏 萌

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071001）

近年來，我國的養(yǎng)殖規(guī)模在不斷擴大，同時養(yǎng)殖環(huán)境也在日益惡化，動物腹瀉性疾病在實際生產(chǎn)中時常發(fā)生，養(yǎng)殖戶為了達到防病、治病的目的，在養(yǎng)殖業(yè)上濫用抗生素的現(xiàn)象普遍存在[1-2]，抗生素的使用雖然提高了生產(chǎn)效益，但是長期使用抗生素導(dǎo)致抗生素藥物有不同程度的殘留，從而嚴重影響人們的身體健康?，F(xiàn)在世界各國都在逐步的取消抗生素飼料添加劑，因此尋找綠色飼料添加劑來代替抗生素是急需解決的問題。

中草藥是我國五千年文明歷史傳承下來的文化遺產(chǎn)，在疾病防治史中占據(jù)重要地位[3-4]，而且與抗生素相比，其擁有低毒、副作用小、安全、有效等特點，越來越受到人們的青睞。例如發(fā)生大腸埃希菌、沙門菌等病原菌感染時，金銀花、黃連、蒲公英、白頭翁等中草藥擁有很好的抗菌作用，療效顯著[5]。大黃作為我國的傳統(tǒng)中藥材之一，主要含大黃酸、大黃多糖、大黃酚、大黃素等，其藥理作用國內(nèi)外研究廣泛，主要有抗腫瘤、活血、清除自由基、抑菌抗炎等作用[6-8]。大黃成分較多，但其炮制方法不同，就可能導(dǎo)致其有效成分的不同，甚至影響其藥理作用和臨床效果[9]。李國旺等利用浸提的方法從大黃中提取有效成分，結(jié)果顯示大黃對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等均有一定的抑菌作用[7]。益生菌作為人體腸道中的一種有益菌能夠調(diào)解腸道菌群，使腸道菌群達到平衡[10]。而有關(guān)益生菌發(fā)酵對大黃體外抑菌作用的影響尚未見報道。

1 試驗材料與方法

1.1 材料

菌種：大腸桿菌(E.Coli)、益生菌N-14，均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程實驗室提供。

試驗原料：大黃（購自河北省安國市中藥材市場）、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉等。

儀器：752型紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司制造）；SPX智能型生化培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；HPX-9052MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實驗有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；BCD-649WE低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）；ZHWY-2112B型雙層搖床（上海智城分析儀器有限公司）；BCD-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海飛越實驗儀器有限公司）；MLS-3020高壓滅菌鍋（SANYO公司）；EN1535型電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化

用竹簽分別挑取斜面保存的N-14益生菌、大腸桿菌，接種于NB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)活化24 h，培養(yǎng)液在4 ℃離心，12 000 r/min，5 min，取上清液用0.2 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.2.2 大黃提取液的制備

將大黃粉碎60目過篩。稱取大黃粉末50 g，加一定量水浸泡1 h，然后于煎鍋中煮沸，再文火持續(xù)煎制30 min，過濾，濾渣同法再進行兩次煎煮，合并濾液離心，5 000 r/min，10 min，旋轉(zhuǎn)濃縮至50 ml（濃度相當于1.0 g/ml），紫外滅菌，4℃冰箱備用。

1.2.3 接種量對發(fā)酵大黃抑菌性的影響

取20 ml大黃煎制液，加入6 g無機鹽，紫外滅菌20 min，然后分別接入1%、2%、3%、4%、5%的N-14，pH值7，37℃搖床培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵大黃對大腸桿菌的抑菌性。

1.2.4 pH值對發(fā)酵大黃抑菌性的影響

其他條件相同情況下，在pH值分別為5、6、7、8、9時培養(yǎng)，測定發(fā)酵大黃對大腸桿菌的抑菌性。

1.2.5 鹽濃度對發(fā)酵大黃抑菌性的影響

其他條件相同情況下，然后分別加入3、4、5、6、7 g的硫酸鎂，測定發(fā)酵大黃對大腸桿菌的抑菌性。

1.2.6 發(fā)酵時間對發(fā)酵大黃抑菌性的影響

其他條件相同情況下，分別培養(yǎng)9、12、18、24 h和36 h，測定發(fā)酵大黃對大腸桿菌的抑菌性。

1.2.7 發(fā)酵溫度對發(fā)酵大黃抑菌性的影響

其他條件相同情況下，分別在 35、37、39、41、43℃時培養(yǎng)，測定發(fā)酵大黃對大腸桿菌的抑菌性。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對發(fā)酵大黃抑菌性的影響

不同接種量對發(fā)酵大黃抑菌性的影響見圖1。由圖1可知，接種量為1%、2%、3%時抑菌性增強了，當接種量為4%、5%時抑菌性又下降了。由于 2%、3%時抑菌性相同，這說明接種量為2%時發(fā)酵大黃對大腸桿菌的抑菌性最強。

圖1 接種量對發(fā)酵大黃抑菌性的影響

2.2 pH值對發(fā)酵大黃抑菌性的影響

pH值對發(fā)酵大黃抑菌性的影響如圖2所示。由圖2看出當pH值由5增至9時，抑菌性整體性是增強的，pH值為7時抑菌性達到最大，pH值為8、9時抑菌性趨于平緩，但略有下降。由此可見，當發(fā)酵pH值為7時，發(fā)酵大黃對大腸桿菌的抑菌性最強。

圖2 pH值對發(fā)酵大黃抑菌性的影響

2.3 鹽濃度對發(fā)酵大黃抑菌性的影響

不同鹽的添加量對發(fā)酵大黃抑菌性的影響如圖3所示，由圖3可知鹽的添加量由3 g增加到6 g時抑菌性是逐漸增強的，添加量為7 g時抑菌性又有所下降。結(jié)果表明，鹽的添加量為6 g時，發(fā)酵大黃對大腸桿菌的抑菌性最強。

圖3 鹽濃度對發(fā)酵大黃抑菌性的影響

2.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵大黃抑菌性的影響

發(fā)酵時間對發(fā)酵大黃抑菌性的影響如圖4所示，由圖4得知，發(fā)酵時間在6～24 h時，發(fā)酵大黃的抑菌性是逐漸增強的，到達30 h時，抑菌性又有所下降。由此可知，發(fā)酵大黃24 h，此時大黃對大腸桿菌的抑菌性最強。

圖4 發(fā)酵時間對發(fā)酵大黃抑菌性的影響

2.5 發(fā)酵溫度對發(fā)酵大黃抑菌性的影響

發(fā)酵溫度對發(fā)酵大黃抑菌性的影響如圖5所示，由圖5可知，發(fā)酵溫度開始升高時，抑菌性是增強的，當溫度達到37℃時，抑菌性達到最大，39、41℃時趨于平緩，略有下降，43℃時下降較大。由此可知，發(fā)酵溫度為37℃時，發(fā)酵大黃對大腸桿菌的抑菌性最強。

圖5 發(fā)酵溫度對發(fā)酵大黃抑菌性的影響

2.6 大黃發(fā)酵液對大腸桿菌抑菌效果

從圖6和表1可以看出，N-14大黃發(fā)酵液對大腸桿菌抑菌圈直徑為16.7 mm，未發(fā)酵大黃對大腸桿菌抑菌圈直徑為11.0 mm。說明大黃發(fā)酵后N-14對大腸桿菌的抑菌性增強。

圖6 抑菌活性測定結(jié)果

表1 抑菌圈直徑

3 討論

我國是世界上植物資源大國，中草藥在我國的防病治病中占有重要地位。傳統(tǒng)的中藥提取主要是中藥水煎或醇提法。四千多年前，我國人民就利用發(fā)酵技術(shù)來制作食品，后來又利用微生物來對天然產(chǎn)物進行發(fā)酵。中藥發(fā)酵繼承了傳統(tǒng)的中藥炮制法，利用現(xiàn)在微生態(tài)學(xué)的成果知識，結(jié)合現(xiàn)代微生物工程形成的中藥制藥新技術(shù)[11-12]。微生物在發(fā)酵中藥時，可以產(chǎn)生一些能夠分解轉(zhuǎn)化物質(zhì)能力的微生物，并能夠產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物，如纖維素酶、木質(zhì)素酶、淀粉酶、蛋白酶等，以消化植物的細胞壁，釋放活性成分，提高中藥有效成分含量，大分子物質(zhì)降解為小分子物質(zhì)，增強中藥提取物的生物活性，降低藥物毒性成分，節(jié)約藥用資源，產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，最終擴大用藥范圍，增強藥物的療效[2，11]。

中藥的發(fā)酵受多方面的影響：①溫度是影響微生物生長的最重要因素之一，參與細胞內(nèi)生化反應(yīng)酶的活性與溫度息息相關(guān)，溫度較低或較高都會影響菌種的活性，從而導(dǎo)致有效成分提高率下降[13-14]；②接種量也是影響微生物發(fā)酵的重要因素，當接種量增大時，發(fā)酵速度會隨之加快，但是接種量過大(超過3%時)菌種的繁殖和呼吸作用會加快，菌種用于呼吸及繁殖時就會消耗發(fā)酵培養(yǎng)基中的大量有效成分，不利于有效成分的積累[15]；③微生物的發(fā)酵時間也不是越長越好，發(fā)酵過程中產(chǎn)物高峰生產(chǎn)階段時間越長，生產(chǎn)率也越高，到一定時間后產(chǎn)物產(chǎn)量會減緩下降[16]，除此之外，pH值、鹽濃度、鹽離子種類等也會影響中藥的發(fā)酵，所以選擇最佳條件發(fā)酵中藥，使得中藥達到最大的療效。

我國的發(fā)酵技術(shù)雖然歷史悠久，但中藥益生菌發(fā)酵仍處于起步階段，存在諸多問題，例如：單一菌種還是混合菌種的選擇，單味中藥和復(fù)方中藥的選擇，生物制品和創(chuàng)新藥物的定位問題等。目前，我國已將中藥發(fā)酵工程列為“十二五”計劃，益生菌發(fā)酵中藥定會取得長足的發(fā)展。

4 結(jié)論

通過利用益生菌N-14對大黃進行發(fā)酵，發(fā)酵大黃與水煎液大黃相比，對大腸桿菌的抑制作用大大增強，發(fā)酵條件為：pH值7，鹽離子MgSO4為 6 g，接種量2%，溫度37℃，時間24 h。此條件下發(fā)酵大黃對大腸桿菌的抑菌效果最好。