■閆志宇 李術(shù)娜 李紅亞 徐麗娜 朱寶成

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071001；2.河北工程大學(xué)科技處，河北邯鄲 056038）

近年來(lái)，隨著我國(guó)畜牧業(yè)集約化、規(guī)模化發(fā)展，魚粉、肉粉等常規(guī)動(dòng)物蛋白飼料價(jià)格不斷上漲，供求形勢(shì)日益緊張，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的成本壓力，蛋白質(zhì)飼料資源嚴(yán)重短缺成為限制我國(guó)飼料工業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一。開發(fā)新的蛋白質(zhì)飼料資源成為關(guān)注熱點(diǎn)。與此同時(shí)，我國(guó)的家禽養(yǎng)殖業(yè)每年產(chǎn)生幾十萬(wàn)噸的羽毛、蹄角等副產(chǎn)物，這些羽毛實(shí)際上營(yíng)養(yǎng)豐富，其粗蛋白含量超過(guò)80%，氨基酸總量達(dá)到70%以上，尤其是半胱氨酸和胱氨酸含量為天然蛋白質(zhì)飼料之冠；同時(shí)富含多種微量元素、維生素及生長(zhǎng)因子，具有良好的利用價(jià)值[1-2]。然而，目前羽毛角蛋白的利用程度卻較低，大量羽毛因無(wú)法被合理利用而遭廢棄，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)同時(shí)帶來(lái)環(huán)境危害。因此加強(qiáng)羽毛類角蛋白的加工利用，不僅能在一定程度上緩解我國(guó)動(dòng)物飼料蛋白源不足的狀況，而且還能解決因羽毛大量積壓產(chǎn)生的環(huán)境問題。

研究報(bào)道，角蛋白可以作為飼料添加劑促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng)，如栗曉霞等利用對(duì)酶解羽毛粉部分代替蛋雞飼料中的植物蛋白，發(fā)現(xiàn)添加2.5%和5%的酶解羽毛粉對(duì)蛋雞各生長(zhǎng)指標(biāo)均無(wú)顯著性影響[3]。Heugten等[4]用羽毛粉在生長(zhǎng)肥育豬日糧中以8%的比例添加，收到很高的經(jīng)濟(jì)效益。王劍平等將羽毛粉飼喂牛等反芻動(dòng)物，均取得一定收效[5]。劉曉霞等[6]用膨化羽毛粉飼喂1日齡櫻桃谷肉鴨試驗(yàn)表明，加3%、4%、5%膨化羽毛粉試驗(yàn)組的平均增重均明顯高于對(duì)照組，試驗(yàn)組的單位增重飼料消耗量均低于對(duì)照組，尤其是以添加4%試驗(yàn)組效果最佳。

傳統(tǒng)的物理、化學(xué)法降解羽毛角蛋白，存在參數(shù)不易控制、高能耗、環(huán)境污染、三廢不易處理、某些必需氨基酸損失、生產(chǎn)的羽毛粉消化率低等問題[7-8]。采用微生物處理羽毛廢棄物，不僅能克服上述弊端，且微生物的生長(zhǎng)代謝還會(huì)產(chǎn)生一些對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)有益的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)成分加以補(bǔ)充。因此，利用微生物發(fā)酵技術(shù)來(lái)解決角蛋白的分解利用近年來(lái)越來(lái)越受關(guān)注。

盡管羽毛角蛋白的飼喂效果已經(jīng)得到肯定，但羽毛飼料蛋白的微生物發(fā)酵降解法尚處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，真正規(guī)?；a(chǎn)的很少，主要原因就在于工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中需要消耗大量的能源，致使生成羽毛粉的成本較高。因此，要想推進(jìn)角蛋白在飼料行業(yè)的應(yīng)用，必須不斷篩選高活性產(chǎn)酶菌株、增加現(xiàn)有菌株的產(chǎn)酶活性、多方探索降低成本的發(fā)酵工藝。

菌株Bacillus subtilis A1-2是實(shí)驗(yàn)室前期篩選到的特異性角蛋白酶菌株，角蛋白酶酶活較高且具有較好酶學(xué)特性，在A1-2菌株的羽毛降解產(chǎn)物中檢測(cè)到13種氨基酸，其中酪氨酸含量最高，達(dá)到68.81%，其次是甲硫氨酸、纈氨酸和半胱氨酸，所占比例分別為8.730%、7.928%和7.068%，且降解液中富含鈣、鎂、硅、鐵、鋅等微量元素，其中鈣含量達(dá)到了1.697 mg/l，硅的含量為1.56 mg/l；表明其在飼料行業(yè)中具有較好的應(yīng)用潛力。筆者進(jìn)一步對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在使其發(fā)酵水平得以提高，降低生產(chǎn)成本，以期為將該菌株應(yīng)用于角蛋白飼料化利用的生產(chǎn)實(shí)踐奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis A1-2，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基（W/V）

NA培養(yǎng)基：NaCl 1.0%、蛋白胨1.0%、牛肉膏0.5%、瓊脂2.0%，pH值7.2～7.4；用于菌種保藏與活化。

種子培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基的液體形式；用于種子液制備。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源1.0%，氮源1.0%，NaH2PO4·2H2O 0.2%，Na2HPO4·2H2O 0.4%，CaCl20.5%，pH值7.0～7.2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 斜面活化與種子液培養(yǎng)

用接種環(huán)刮取供試菌A1-2的斜面菌苔轉(zhuǎn)接至NA斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接至液體種子培養(yǎng)基，200 r/min，37 ℃，搖床震蕩培養(yǎng)16 h后使用。

1.2.2 Bacillus subtilus A1-2菌株產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.2.1 適合菌株產(chǎn)酶的誘導(dǎo)物、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及表面活性劑種類

單因素改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)物、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及表面活性劑等條件，配制不同的發(fā)酵培養(yǎng)基。將配制好的液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250 ml三角瓶中，每瓶裝量50 ml，121℃濕熱滅菌20 min。然后按4.0%的接種量接種1.2.1節(jié)中培養(yǎng)好的液體菌種，于200 r/min，30℃，搖床震蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液10 000 r/min高速離心15 min去除菌體，取其上清用以測(cè)定角蛋白酶活力。

1.2.2.2 菌株產(chǎn)酶的培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)

以菌體液體發(fā)酵產(chǎn)生的角蛋白酶活力為檢測(cè)指標(biāo)，選擇上述對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)酶有影響的碳源、氮源、誘導(dǎo)物羽毛粉、金屬離子和表面活性劑為因變量，采用L16(45)正交表設(shè)計(jì)和安排試驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化。

試驗(yàn)時(shí)三角瓶中裝液量50 ml/250 ml，接種量4.0%，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，37℃恒溫培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液上清的酶活力。

1.2.3 供試菌株最適發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用1.2.2節(jié)優(yōu)化出的培養(yǎng)基，單因素改變pH值、接種量、裝液量及發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等參數(shù)，通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)測(cè)定酶活力的方法來(lái)考察最適發(fā)酵條件。

1.2.4 酶活力測(cè)定方法[9]

發(fā)酵液經(jīng)離心除菌，取其上清液1 ml，加2 ml Tris-HCl Buffer和10.0 mg羽毛粉（研磨機(jī)研碎至80目），置于40℃水浴保溫振蕩反應(yīng)6 h，然后加入2 ml 10%TCA終止反應(yīng)。30 min后，8 000 r/min，4℃離心15 min，上清液于280 nm處測(cè)定OD值（對(duì)照試驗(yàn)先加入TCA終止液）。

酶活力定義：以試驗(yàn)組與對(duì)照組在280 nm處測(cè)定的吸光度OD值的差值表示，吸光度值每增加1所需的酶量為1 U。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株A1-2液體發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 不同誘導(dǎo)物對(duì)菌株A1-2發(fā)酵產(chǎn)酶的影響（見圖1）

分別在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1.0%羽毛、80目羽毛粉、指甲為誘導(dǎo)物，并以不加任何誘導(dǎo)物作為空白對(duì)照，每處理3個(gè)平行。接種量4.0%，裝液量50 ml/250 ml，將菌株經(jīng)200 r/min，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)72 h后測(cè)定發(fā)酵液上清的酶活力。結(jié)果表明，Bacillus subtilus A1-2菌株所產(chǎn)的角蛋白酶為誘導(dǎo)酶，羽毛和羽毛粉對(duì)其產(chǎn)角蛋白酶都具誘導(dǎo)作用，而指甲基本上無(wú)誘導(dǎo)作用，且羽毛粉誘導(dǎo)酶的合成效果最為顯著。可能是由于羽毛粉經(jīng)過(guò)粉碎處理其顆粒較小，與菌體接觸更全面，更容易被菌株降解和利用。

圖1 誘導(dǎo)物種類對(duì)菌株A1-2產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.1.2 碳源種類對(duì)菌株A1-2產(chǎn)角蛋白酶的影響（見圖2）

圖2 不同碳源對(duì)菌株A1-2產(chǎn)角蛋白酶的影響

分別以葡萄糖、蔗糖、糊精、可溶性淀粉和玉米粉作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，添加量均為1.0%，每種碳源設(shè)3個(gè)平行。相同條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h后測(cè)定不同碳源的發(fā)酵液中角蛋白酶活力。由圖2可以看出：碳源種類對(duì)供試菌株產(chǎn)酶產(chǎn)生一定的影響，碳源為玉米粉、糊精、淀粉時(shí)對(duì)菌株產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，玉米粉效果最佳；而葡萄糖、蔗糖則對(duì)菌株產(chǎn)酶產(chǎn)生一定的抑制作用。這可能是由于玉米粉出糖類物質(zhì)外還含有較豐富的蛋白質(zhì)與維生素，在提供碳源的同時(shí)，也提供了氮源與生長(zhǎng)因子，為菌株提供較好的生長(zhǎng)與代謝環(huán)境，從而提高了產(chǎn)酶效率。

2.1.3 氮源種類對(duì)菌株A1-2產(chǎn)角蛋白酶的影響（見圖3）

以1.0%的玉米粉作為碳源，分別以1.0%的硝酸鹽、硫酸銨、酪蛋白、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏和黃豆餅粉作為氮源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，每項(xiàng)3個(gè)平行。相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定供試菌株在不同氮源下的酶活。由圖3可以看出，有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源有更有利于菌株的生長(zhǎng)代謝，其中黃豆餅粉對(duì)于供試菌株的產(chǎn)酶促進(jìn)作用最強(qiáng)，其次是酵母膏和酪蛋白，但基于酪蛋白和酵母膏的成本相對(duì)較高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，因此應(yīng)選取黃豆餅粉作為菌株產(chǎn)角蛋白酶的最適氮源。

圖3 不同氮源對(duì)菌株A1-2產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.1.4 金屬離子對(duì)菌株A1-2產(chǎn)角蛋白酶的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基以1.0%玉米粉為碳源，1.0%黃豆餅粉為氮源，分別加入0.5%濃度的不同金屬離子，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)，考察金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同金屬離子對(duì)菌株A1-2產(chǎn)角蛋白酶的影響

從圖4可以看出，添加Ca2+促進(jìn)了菌株產(chǎn)酶，但影響不顯著，其它離子(Cu2+、Zn2+、Mn2+)對(duì)菌株產(chǎn)酶都有不同的抑制作用，而Cu2+幾乎可以完全抑制菌株產(chǎn)酶。

2.1.5 添加表面活性劑對(duì)菌株A1-2發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

所得上述發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加1.0%不同的表面活性劑(TritonX-100、吐溫-80、SDS)，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)，考察表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同表面活性劑對(duì)菌株A1-2產(chǎn)角蛋白酶的影響

從圖5可以看出：吐溫-80對(duì)菌株產(chǎn)酶具有促進(jìn)作用；TritonX-100和SDS對(duì)菌株產(chǎn)酶具有抑制作用，這可能是吐溫-80可以改善細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)胞外酶的分泌，使產(chǎn)酶活性提高。

2.1.6 培養(yǎng)基組成的正交試驗(yàn)

綜合以上各單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4水平的L16(45)正交試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 培養(yǎng)基組成的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)正交試驗(yàn)的直觀分析結(jié)果，極差值R黃豆餅粉＞R羽毛粉＞R玉米粉＞R吐溫-80＞ RCa2+，因此，黃豆餅粉為主要影響因素，羽毛粉次之。由表1可見，8號(hào)組合的酶活最高，達(dá)到582.0 U/ml，根據(jù)均值K得出最佳組合為A4B4C4D2E1，但是在正交試驗(yàn)表中沒有這個(gè)組合，通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該組合發(fā)酵液的酶活為591.6 U/ml，因此確定該菌株培養(yǎng)的最佳組合為玉米粉3.0%，黃豆餅粉3.0%，羽毛粉3.0%，CaCl20.5%，吐溫-80 0.5%。

2.2 菌株A1-2產(chǎn)角蛋白酶的發(fā)酵條件

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基最適起始pH值的確定

以2.1節(jié)得到的試驗(yàn)結(jié)果配制發(fā)酵培養(yǎng)基，接種前用NaOH或HCl調(diào)整培養(yǎng)基起始pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，每處理3個(gè)平行。接種量4%，200 r/min，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)72 h后測(cè)定供試菌株發(fā)酵液上清的酶活。

圖6 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)菌株A1-2產(chǎn)角蛋白酶活的影響

從圖6中可以看到，當(dāng)培養(yǎng)基起始pH值為8.0時(shí)，菌株產(chǎn)酶活力最高，與該菌株的最適生長(zhǎng)pH值范圍一致；pH值小于7或大于8.5時(shí)，酶活明顯降低。

2.2.2 接種量對(duì)菌株A1-2發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

配制最佳發(fā)酵培養(yǎng)基并調(diào)整其初始pH值為8.0，分別以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%接種量接入培養(yǎng)16 h的種子液，每處理3個(gè)平行。200 r/min，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)72 h后測(cè)定供試菌株發(fā)酵液上清的酶活，結(jié)果見圖7。

圖7 不同接種量對(duì)菌株A1-2產(chǎn)角蛋白酶的影響

從圖7可以看出，當(dāng)接種量為6.0%時(shí)，菌株發(fā)酵產(chǎn)酶最高。當(dāng)接種量較小時(shí)，菌體數(shù)量較少，不能快速大量繁殖，導(dǎo)致蛋白分泌較少，當(dāng)接種量較大時(shí)，菌體間產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)，從而導(dǎo)致蛋白分泌減少。

2.2.3 裝液量對(duì)菌株A1-2發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

配制最佳發(fā)酵培養(yǎng)基并調(diào)整其初始pH值8.0，在250 ml容量瓶中分別加入30，40、50、75 ml和100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基，設(shè)定5種不同的裝液量，每處理3個(gè)平行，均按照6.0%的比例接入種子液。結(jié)果見圖8。

圖8 搖瓶裝液量對(duì)菌株A1-2產(chǎn)角蛋白酶活產(chǎn)酶的影響

從圖8可以看出，當(dāng)裝液量在30 ml時(shí)酶活達(dá)到最大，隨著裝液量的增大，酶活力呈減弱趨勢(shì)，可能由于作為好氧菌株，菌株在生長(zhǎng)代謝時(shí)需要足夠的氧氣，而當(dāng)裝液量較大時(shí)，系統(tǒng)不能為菌株提供充足的氧氣，導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)緩慢。同時(shí)，由于裝液量過(guò)小，容易導(dǎo)致培養(yǎng)基蒸發(fā)變干，不利于后期的測(cè)定和工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2.4 最適發(fā)酵溫度的確定

配制最佳發(fā)酵培養(yǎng)基并調(diào)整其初始pH值8.0，裝液量30 ml/250 ml三角瓶，接種量6.0%，將已接種的發(fā)酵培養(yǎng)基分別置于28、30、37、42℃溫度的搖床中培養(yǎng)，每組3個(gè)平行，轉(zhuǎn)速200 r/min，72 h后測(cè)定酶活。從圖9可以看出，溫度在37℃的時(shí)候酶活力最大，隨著溫度的升高和降低，酶活都有所降低。

圖9 發(fā)酵溫度對(duì)菌株A1-2產(chǎn)角蛋白酶活的影響

2.2.5 最適發(fā)酵時(shí)間的確定

配制最佳發(fā)酵培養(yǎng)基并調(diào)整其初始pH值8.0，裝液量30 ml/250 ml三角瓶，接種量6.0%，將已接種的發(fā)酵培養(yǎng)基分別在37℃搖床中震蕩培養(yǎng)36、48、60、72 h后測(cè)定酶活。從圖10可以看出，發(fā)酵時(shí)間在60 h酶活力達(dá)到最大；酶屬于菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其積累需要較長(zhǎng)時(shí)間；但是，發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌株的其他代謝產(chǎn)物也會(huì)增加，反而不利于其繼續(xù)產(chǎn)酶，甚至?xí)斐赡康漠a(chǎn)物的分解。

圖10 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株A1-2產(chǎn)角蛋白酶活的影響

2.3 優(yōu)化條件下菌株的產(chǎn)酶能力

集合上述優(yōu)化發(fā)酵條件，對(duì)菌株A1-2進(jìn)行搖床液體深層發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶活力測(cè)定，經(jīng)過(guò)3個(gè)批次的試驗(yàn)驗(yàn)證，菌株在此條件下的產(chǎn)酶能力平均為642.1 U/ml。

3 討論

角蛋白酶一般是芽孢桿菌在發(fā)酵后期產(chǎn)生的，是芽孢桿菌的次生代謝物，這通常受到培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分、發(fā)酵條件和高度復(fù)雜的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的影響，不同培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵條件可顯著影響不同代謝物質(zhì)的產(chǎn)量[10-12]。前期研究表明角蛋白分解菌株A1-2的性能優(yōu)良，但若缺乏合理的發(fā)酵工藝，也不能將其潛力充分發(fā)揮。菌株發(fā)酵除受營(yíng)養(yǎng)因素的限制以外，合適的發(fā)酵條件也是不可忽視的重要因素[13-14]。

本文在考慮角蛋白酶活力與產(chǎn)量的同時(shí)，還考慮了成本和效率的問題，為中試及大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵條件的摸索提供了依據(jù)。由于發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜動(dòng)態(tài)的生命過(guò)程，而本研究只對(duì)培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，為了使其產(chǎn)業(yè)化，還需采用生化等方法對(duì)其代謝過(guò)程進(jìn)行研究

4 結(jié)論

菌株A1-2是經(jīng)篩選得到的對(duì)角蛋白有較好降解能力的優(yōu)良菌株，為了能使其較快的實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)并服務(wù)于動(dòng)物性蛋白飼料資源的開發(fā)，通過(guò)單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化其培養(yǎng)條件，最終得出的較優(yōu)的發(fā)酵條件為：玉米粉3.0%，黃豆餅粉3.0%，80目羽毛粉3.0%，Ca2+0.5%，吐溫-80 0.5%，培養(yǎng)基初始pH值8.0，溫度37℃、接種量6.0%、裝液量30 ml/250 ml三角瓶，轉(zhuǎn)速200 r/min發(fā)酵60 h，酶活力最終達(dá)到642.1 U/ml，比初始酶活328.5 U/ml增高了95.46%。研究結(jié)果為進(jìn)一步探索適用于中試的發(fā)酵條件奠定了一定的基礎(chǔ)。