張小藝 孟紅艷 彭 敏 司 皓 馬宏博

1.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院中醫(yī)科，山東濟(jì)南 250021；2.山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東濟(jì)南 250012

內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）是導(dǎo)致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的重要因素，Toll 樣受體（Toll like receptor，TLR）是LPS 信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的“門戶蛋白”[1]， 其信號(hào)通路的過度激活是導(dǎo)致炎性反應(yīng)爆發(fā)失控的重要機(jī)制。 TLR4 可以選擇性識(shí)別LPS，LPS 與單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞細(xì)胞膜上的TLR4 結(jié)合，引起炎癥瀑布效應(yīng)[2]。 調(diào)節(jié)TLR4 信號(hào)通路有可能成為膿毒癥的一種治療策略[3]。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）近年來取得相當(dāng)大的進(jìn)展，研究人員利用RNAi 作為研究工具引入到細(xì)胞或整個(gè)生物RNAi 試劑，用以識(shí)別新的細(xì)胞通路和潛在的藥物靶點(diǎn)[4]。 慢病毒載體是一種高效率的轉(zhuǎn)基因和基因治療工具，其最大優(yōu)勢(shì)在于能夠感染分裂和靜止?fàn)顟B(tài)下的細(xì)胞，并且能夠高效、穩(wěn)定地整合于宿主細(xì)胞內(nèi)[5]。 本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建TLR4 siRNA 慢病毒載體，轉(zhuǎn)染至大鼠巨噬細(xì)胞NR8383，并通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)TLR4 siRNA 干擾的效果，為進(jìn)一步探討TLR4 信號(hào)通路在ALI 發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制提供研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）反應(yīng)試劑，Primer（R＆F）合成、dsDNA oligo、293T 細(xì)胞株、大腸埃希菌菌株DH5α、病毒載體均由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供；Taq 酶、SYBR Master Mixture 購(gòu)于TaKaRa；Age Ⅰ、EcoRⅠ、T4 DNA ligase、T4 DNA ligase buffer 來 自 于NEB；QIAGEN Plasmid 大抽Kit 來自QIAGEN；Rnase Inhibitor、dNTP、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于Promega；Lipofectamine 2000、Trizol 購(gòu) 自Invitrogen；ECL-PLUS/Kit購(gòu)于Amersham 公司；positive clone 測(cè)序由上海美季生物技術(shù)有限公司完成；胎牛血清、DMEM 購(gòu)自Gibco公司；Opti-MEM 購(gòu)自Invitrogen。

1.2 方法

1.2.1 TLR4 基因RNAi 慢病毒載體構(gòu)建

1.2.1.1 siRNA 靶點(diǎn)設(shè)計(jì) 針對(duì)TLR4 目的基因靶基因序列，采用Invitrogen 軟件（https：//rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/）設(shè)計(jì)4 個(gè)RNA 干擾靶點(diǎn)序列。見表1。

表1 TLR4 siRNA 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

1.2.1.2 RNAi 慢病毒載體構(gòu)建 工具載體選擇GV115，框架結(jié)構(gòu)為hU6-MCS-CMV-EGFP，酶切位點(diǎn)：Age Ⅰ，EcoR Ⅰ。 合成含干擾序列的DNA oligo，經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)Age Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后的載體連接。 見表2。

表2 RNAi 合成片段

1.2.1.3 克隆制備與鑒定 通過T4 DNA ligase 將酶切回收的載體和DNA 片段進(jìn)行鏈接反應(yīng)， 將鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的DH5α 細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子重懸于10 μL LB 溶液，使用GV115 通用引物，進(jìn)行菌落PCR 鑒定實(shí)驗(yàn)。 將PCR 陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)結(jié)果比對(duì)，確認(rèn)測(cè)序引物與鑒定引物中的上游引物相同即為構(gòu)建成功的TLR4 目的基因RNAi 慢病毒載體。測(cè)序結(jié)果通過Chromas 軟件進(jìn)行分析。PCR 鑒定陽(yáng)性克隆的引物為：上游5′-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3′，下游5′-CGCGTGGATAACCGTATTAC-3′。 PCR 鑒定的分組為1：陰性對(duì)照（ddH2O）；2：陰性對(duì)照（空載）；3：Marker 自上而下依次為5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；4：TLR4-RNAi 轉(zhuǎn)化子（a：Tgt-1；b：Tgt-2；c：Tgt-3；d：Tgt-4）。

1.2.2 RNAi 慢病毒小量包裝

制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒，分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提， 在Lipofectamine 2000 介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，培養(yǎng)8 h 后倒去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基， 加入含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集293T 細(xì)胞上清液，過濾離心后取病毒濃縮液，分裝后保存在病毒管中，－80℃保存，取1 支以熒光法進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測(cè)定。

1.2.3 慢病毒感染細(xì)胞

1.2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞大鼠肺巨噬細(xì)胞株NR8383購(gòu)自ATCC 公司，培養(yǎng)于含15%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）、L-谷氨酰胺（2 mmo/L）、NaHCO3（1.5 g/L）的Ham′s F12 培養(yǎng)基中，細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2 NR8383 細(xì)胞慢病毒感染 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383 進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，接種于6-well 培養(yǎng)板培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到約30%， 按設(shè)計(jì)組別分別加入慢病毒顆粒進(jìn)行NR8383 細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn)，12 h 后觀察細(xì)胞狀態(tài)，如無明顯細(xì)胞毒性，連續(xù)培養(yǎng)24 h 后更換培養(yǎng)基。 感染3 d 后熒光顯微鏡下觀察GFP 表達(dá)，熒光率達(dá)80%以上，收集細(xì)胞，感染效率低于80%的實(shí)驗(yàn)組，重新進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。 見表3。

表3 細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)分組和病毒用量

1.2.4 qPCR 內(nèi)源篩靶

收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的目的細(xì)胞， 提取RNA，總RNA 抽提根據(jù)Trizol 操作說明書進(jìn)行。 RNA 逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，按照M-MLV 操作說明書進(jìn)行，采用RTPCR 檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況。TLR4 上游引物序列：5′-ATGAGGACTGGGTGAGAAACG-3′，下游引物序列：5′-ATGCCAGAGCGGCTACTCA-3′， 擴(kuò)增長(zhǎng)度：247 bp；內(nèi)參GAPDH 上游引物序列：5′-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物序列：5′-CTCAGCACCAGCATCACC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度：114 bp。 用TP800 序列檢測(cè)系統(tǒng)軟件（TaKaRa 公司）制作擴(kuò)增曲線并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，依據(jù)2-ΔΔCt數(shù)據(jù)分析法，比較各組TLR4 基因mRNA 表達(dá)水平。

1.2.5 有效靶點(diǎn)慢病毒大量包裝及驗(yàn)證內(nèi)源性目的基因表達(dá)敲減

根據(jù)RT-PCR 結(jié)果，篩選出敲減效率最高的1 個(gè)RNAi 有效靶點(diǎn)，進(jìn)行慢病毒大量包裝。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性克隆的PCR 鑒定

載體上的引物進(jìn)行PCR 鑒定陽(yáng)性克隆， 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其大小和完整性，每個(gè)序列陽(yáng)性克隆各取3 個(gè)樣品菌種送上海美季公司測(cè)序， 結(jié)果通過Chromas 軟件進(jìn)行分析。 鑒定電泳結(jié)果顯示，TLR4 vshRNA 片段已經(jīng)成功插入質(zhì)粒，挑選的陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)要求的DNA 序列完全一致。 見圖1。

2.2 慢病毒滴度測(cè)定

圖1 陽(yáng)性克隆的PCR 鑒定

測(cè)定前1 d 為293T 細(xì)胞鋪板， 每孔加4×104個(gè)細(xì)胞，在Eppendorf 管中加入90 μL 無血清培養(yǎng)基，將10 μL 病毒原液加入到第1 個(gè)管中， 混勻后取10 μL加入到第2 個(gè)管中， 如此分別稀釋為1/10～1/100 萬，感染293T 細(xì)胞，24 h 后加入完全培養(yǎng)基100 μL，4 d后，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，通過GFP 陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定LV-TLR4-RNAi（Tgt-1、2、3、4）的滴度分別為5×108、4×108、4×108、5×108TU/mL。

2.3 慢病毒感染細(xì)胞

感染后16 h 更換培養(yǎng)基，感染后96 h 熒光拍照。圖2 顯示各組慢病毒成功感染NR8383 細(xì)胞。

圖2 熒光顯微鏡下慢病毒感染NR8383 細(xì)胞GFP的表達(dá)（100×）

2.4 RT-PCR 內(nèi)源篩靶

RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，NR8383 細(xì)胞中，相對(duì)于陰性對(duì)照組，KD2 組TLR4 基因敲減效率達(dá)到65%（P ＜0.05）（圖3，封三），認(rèn)為是KD2 有效靶點(diǎn)。

圖3 RT-PCR 檢測(cè)TLR4 mRNA 的表達(dá)

2.5 病毒大量包裝后的靶點(diǎn)再次驗(yàn)證

根據(jù)RT-PCR 篩選結(jié)果，選取敲減效率最高的KD2 號(hào)靶點(diǎn)進(jìn)行病毒的大量包裝后， 經(jīng)定量PCR 測(cè)定，在NR8383 細(xì)胞中，相對(duì)于NC、KD2 組TLR4 基因敲減效率達(dá)到90.1%（P ＜0.05）。

3 討論

ALI 發(fā)病的關(guān)鍵是一種肺內(nèi)過度性、失控性的炎性反應(yīng)， 多種炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)相互的激活與釋放，導(dǎo)致瀑布式的炎性反應(yīng)，形成肺的過度損傷[6-7]。研究表明，ALI 患者TLR4 的表達(dá)水平與急性肺部炎癥程度及氣道上皮細(xì)胞的損傷、肺部中性粒細(xì)胞增加相關(guān)[8]。TLR4 可以早期識(shí)別侵入體內(nèi)的細(xì)菌啟動(dòng)炎性反應(yīng)，核因子（NF）-κB、激活蛋白-1（AP-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等的激活均為其下游事件， 最終導(dǎo)致多種炎性因子的瀑布式釋放，放大炎癥效應(yīng)[9]。 研究證實(shí)，TLR4 基因缺陷小鼠對(duì)內(nèi)毒素的敏感性明顯下降，肺組織病理?yè)p傷和肺水腫程度減輕[10]，以TLR4 基因?yàn)榘悬c(diǎn)，從上游調(diào)控這種瀑布式的炎癥效應(yīng)，可為治療急性感染性疾病提供一種新的策略[11]。

RNAi 技術(shù)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的基因沉默技術(shù)，RNAi 能夠非常特異地降解與之序列相應(yīng)單個(gè)內(nèi)源基因mRNA， 相對(duì)少量的dsRNA 就可以使表型達(dá)到缺失突變體程度，抑制基因表達(dá)效率很高[12-14]，已成為研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的良好工具。 RNAi 技術(shù)在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)增強(qiáng)免疫反應(yīng)、控制炎癥和治療自身免疫性疾病中都發(fā)揮了作用[15]。

RNAi 的沉默效應(yīng)與基因的轉(zhuǎn)染效率密切相關(guān)[16]?；蜣D(zhuǎn)染的方法可分為病毒轉(zhuǎn)染和非病毒轉(zhuǎn)染，常用的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒載體[17]。 慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV-1）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，可感染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞， 轉(zhuǎn)移基因片段容量較大，目的基因表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)，還可整合到宿主細(xì)胞的染色體基因組上，不易引發(fā)宿主免疫反應(yīng)[18-20]，已成為基因功能研究及基因治療領(lǐng)域中熱門的基因轉(zhuǎn)移載體[21]。

本研究成功構(gòu)建了4 個(gè)TLR4 基因RNAi 慢病毒表達(dá)載體， 具有較高滴度，4 種慢病毒載體感染大鼠肺巨噬細(xì)胞NR8383 后，TLR4 基因mRNA 表達(dá)量均明顯下降，其中LV-TLR4-RNAi（Tgt-2）抑制作用最明顯，使mRNA 表達(dá)下降65%，將2 號(hào)靶點(diǎn)進(jìn)行病毒的大量包裝后，TLR4 基因敲減效率達(dá)到90.1%，表明本研究構(gòu)建的慢病毒RNAi 表達(dá)載體在NR8383 細(xì)胞內(nèi)能有效地沉默TLR4 基因表達(dá)， 為后續(xù)研究TLR4信號(hào)通路在ALI 發(fā)病過程中的作用及中藥干預(yù)的靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

[1] S?emann MD，Weichhart T，Zeyda M，et al. Tamm-Horsfall glycoprotein links innate immune cell activation with adaptive immunity via a Toll-like receptor-4 dependent mechanism [J]. J Clin Invest，2005，115（2）：468-475.

[2] 王晶晶，楊敬平，齊明祿.TLR4 介導(dǎo)的信號(hào)通路與膿毒癥相關(guān)性研究[J].臨床肺科雜志，2015，20（4）：725-727.

[3] Wittebole X，Castanares-Zapatero D，Laterre PF. Toll-like receptor 4 modulation as a strategy to treat sepsis [J]. Mediators Inflamm，2010，2010：568396.

[4] Stephanie EM，Jennifer AS，Caroline ES，et al.RNAi screening comes of age：improved techniques and complementary approaches [J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2014，15（9）：591-600.

[5] 張曼，孫秀萍，宋銘晶.慢病毒載體用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2014，8（10）：1949-1953.

[6] 李玉梅，衛(wèi)洪.ALI/ARDS 抗炎治療研究的策略與展望[J].中國(guó)病理生理雜志，2009，25（4）：813-816，825.

[7] 雷馬文，王德明.miRNA：急性肺損傷中新的調(diào)控分子[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（11）：27-28.

[8] Togbe D，Schnyder-Candrian S，Schnyder B，et al. TLR4 gene dosage contributes to endotoxin-induced acute respiratory inflammation [J]. J Leukoc Biol，2006，80（3）：451-457.

[9] 唐婧，莫中成，王德明.TLR4 在急性肺損傷中的作用[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2013，41（5）：516-519.

[10] 張進(jìn)祥，王慧，徐建波，等.Toll 樣受體4 在急性肺損傷中的作用[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2006，15（8）：692-695.

[11] 王娜，張雪梅，陳立杰.TLR4 信號(hào)通路與炎癥相關(guān)性疾病[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2015，19（5）：857-860.

[12] Moffat J，Sabatini DM. Building mammalian signalling pathways with RNAi screens [J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2006，7（3）：177-187.

[13] 李再新，王慧.RNAi 作用機(jī)制及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].四川理工學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，18（3）：19-21.

[14] Chad VP，George AC，Robert LC，et al. RNA interference in the clinic：challenges and future directions [J]. Nat Rev Cancer，2011，11（1）：59-67.

[15] Chih-PM，YenYL，ChienFH，et al. Immunological research using RNA interference technology [J]. Immunology，2007，121（3）：295-307.

[16] 阮靜，王旭，李煜生，等.沉默Toll 樣受體4 基因表達(dá)的RNAi 慢病毒載體的構(gòu)建[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（20）：3693-3696.

[17] 陳巖，賴垂金，李雯，等.不同基因轉(zhuǎn)染方法對(duì)小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的比較[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志，2015，23（2）：166-169.

[18] 喻鈞，潘鐵成，魏翔，等.TLR3 基因RNAi 慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，42（2）：167-171.

[19] 丁震宇，梁后杰.慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi 的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2009，38（4）：15-19.

[20] 孟凡榮，陳琛，萬海粟，等.慢病毒載體及其研究進(jìn)展[J].中國(guó)肺癌雜志，2014，17（12）：870-876.

[21] Pluta K，Kacprzak MM. Use of HIV as a gene transfer vector [J]. Acta Biochim Pol，2009，56（4）：531-595.