雍太萍 華云鵬 宗寧峰 畢 慧 陸 瑜

解放軍第四五四醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南京 210002

金水寶膠囊主要成分是冬蟲夏草分離純化的蟲草菌-蝙蝠蛾擬青霉CS-4 菌株， 經(jīng)人工發(fā)酵培養(yǎng)加工而成[1-4]。該藥具有補(bǔ)腎養(yǎng)肺、固精益氣、增強(qiáng)免疫力之功效[5-10]。 臨床上廣泛用于治療肺腎兩虛、精氣不足所致的咳嗽多喘、全身無(wú)力、失眠多忘、月經(jīng)不調(diào)、腰膝酸軟等[11-18]。

本研究旨在建立一種選擇性好、快速簡(jiǎn)便的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法同時(shí)測(cè)定金水寶膠囊中5 種成分的質(zhì)量濃度， 為控制金水寶膠囊的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 藥品與試劑

金水寶膠囊（江西濟(jì)民可信金水寶制藥有限公司，批號(hào)：150422、150515、150616）；標(biāo)準(zhǔn)品：腺苷（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：13081813，純度：99.2%）、胞苷（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：13062509，純度：98.9%）、鳥苷（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：13091006，純度：99.3%）、甘露醇（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：13110812，純度：99.5%）、腺嘌呤（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：13120812，純度：99.2%）。 其他相關(guān)試劑均為色譜純。

1.2 儀器

Agilent 1290 超高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；Agilent G6430 質(zhì) 譜 儀，MassHunter 色 譜 工 作 站（美國(guó)Agilent 公司）；Precisa XS225A 十萬(wàn)分之一分析天平；AnkeTDL-40B 離心機(jī)（上?？茖W(xué)安瓶科學(xué)儀器制造廠）； 渦旋混合器ZH-2 （天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；Drict-Q5 超純水機(jī)（法國(guó)Millipore 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（5∶95，V/V）；色譜柱：Agilent ZOBAX SB C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流速：200 μL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。 采取自動(dòng)進(jìn)樣方式。 離子化模式：正離子；定量模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；毛細(xì)管電壓：4000 V；干燥氣溫度：400℃；腺苷的Fragmentor 及CE 值分別為100、20 V；胞苷的Fragmentor 及CE 值分別為100、10 V；鳥苷的Fragmentor 及CE 值分別為90、10 V； 甘露醇的Fragmentor 及CE 值分別為70、10 V； 腺嘌呤的Fragmentor 及CE 值分別為100、30 V； 檢測(cè)對(duì)象： 腺苷m/z 268.1→m/z 136；胞苷m/z 244.2→m/z 112.1；鳥苷m/z 284.1→m/z 152.1；甘露醇m/z 183.1→m/z 69；腺嘌呤m/z 136.1→m/z 119.1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取標(biāo)準(zhǔn)品腺嘌呤、腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇適量，精密稱定，用50%甲醇溶解并定容，制成腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤質(zhì)量濃度分別為320、160、480、3200、320 ng/mL 的混合對(duì)照品溶液。依次進(jìn)行倍比稀釋，外標(biāo)法定量分析。結(jié)果見表1。

表1 5 種化學(xué)對(duì)照品UPLC-MS/MS 分析濃度（ng/mL）

2.2.2 供試品溶液的制備 取金水寶膠囊內(nèi)容物，研磨均勻，精密稱取0.5 g，置于50 mL 容量瓶中，用90%甲醇溶解并定容，超聲處理30 min（功率：45 kHz），搖勻，濾過(guò)。精密吸取上清液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，見圖1。

圖1 液-質(zhì)聯(lián)用離子流圖

2.3 線性關(guān)系考察

使用“2.2.1”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，以各化合物峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤的質(zhì)量濃度在相應(yīng)范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。 見表2。

表2 金水寶膠囊中5 種成分的線性回歸結(jié)果

2.4 精密度試驗(yàn)

取低、中、高3 個(gè)濃度（HB5、HB4、HB2）的混合對(duì)照品溶液分別重復(fù)進(jìn)樣5 次，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果腺苷的RSD 分別為3.1%、1.9%、2.8%（n=5）；胞苷的RSD 分別為3.3%、3.2%、3.8%（n=5）； 鳥苷的RSD 分別為2.4%、2.8%、1.9%（n = 5）；甘露醇的RSD 分別為3.9%、4.1%、3.5%（n = 5）；腺嘌呤的RSD 分別為4.1%、3.8%、3.5%（n = 5），實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法的要求[19]附錄130-131。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：150515），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置于進(jìn)樣室中，放置0、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣記錄峰面積。 結(jié)果腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤峰面積的RSD 分別為3.5%、2.2%、2.6%、3.1%、3.1%（n = 5），結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定均較好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：150515），共6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，配制供試品溶液。 按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、 腺嘌呤峰面積的RSD 分別為3.2%、3.4%、2.6%、2.8%、3.1%（n = 6），符合試驗(yàn)要求。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定批號(hào)為150515 的樣品約0.25 g，精密加入各對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，依法測(cè)定并計(jì)算回收率。 結(jié)果見表3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法的要求[19]824-825。

2.8 樣品含量測(cè)定

取3 批金水寶膠囊，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算每批金水寶膠囊中腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤的含量，結(jié)果見表4。

表3 加樣回收率試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果（n = 6）

表4 金水寶膠囊中5 個(gè)化合物含量測(cè)定結(jié)果（n = 3）

3 討論

金水寶膠囊中的胞苷含量較低，紫外響應(yīng)也較低，無(wú)法使用HPLC 法進(jìn)行含量測(cè)定，同時(shí)，由于金水寶膠囊中化合物較多，不同成分之間相互干擾，這嚴(yán)重影響了相關(guān)成分的準(zhǔn)確定量，故本實(shí)驗(yàn)最終選擇分析速度快、靈敏度高的UPLC-MS/MS 法進(jìn)行定量分析。

本試驗(yàn)也考察了不同色譜柱、流動(dòng)相及質(zhì)譜條件對(duì)化合物定量的影響， 結(jié)果表明，Agilent ZOBAX SB C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）效果較為理想，各化合物峰形良好，保留時(shí)間適中。 正離子模式下各化合物離子化效率高。 使用甲醇∶0.1%甲酸水溶液=5∶95時(shí)，各化合物分離較好，無(wú)相互干擾，出峰時(shí)間短。

2010 年版《中國(guó)藥典》中金水寶膠囊僅采用HPLC測(cè)定其中腺苷的含量[19]824-825，而本研究采用UPLCMS/MS 法同時(shí)測(cè)定金水寶膠囊中腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤的含量，該方法具有干擾少、分析時(shí)間短、靈敏度高、專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)[20-23]，為全面控制金水寶膠囊提供了可靠而簡(jiǎn)單的方法。

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