舒明 王火平 胡笑蓉 黃左安 黃丹丹 王咖 張順

肝硬化大鼠肝缺血-再灌注損傷后Bsep、Mrp2表達在膽汁淤積中的作用研究

舒明 王火平 胡笑蓉 黃左安 黃丹丹 王咖 張順

目的研究肝硬化大鼠肝缺血-再灌注損傷（HIRI）后膽汁淤積的部分分子機制。方法將健康SD大鼠隨機分成A、B、C 3組，每組15只，建立肝硬化、HIRI模型。A組為正常大鼠HIRI組，B組為肝硬化大鼠假手術(shù)組，C組為肝硬化大鼠HIRI組。每組大鼠肝門阻斷時間為30min。分別檢測各組大鼠術(shù)后第1、3、5天的膽汁DBil、TBil含量，血清AST、ALT、TBil、DBil含量；Western blot分析各組大鼠術(shù)后第1、3、5天膽鹽輸出泵（Bsep）、多耐藥相關(guān)蛋白2（Mrp2）表達變化；免疫組織化學法分析Bsep蛋白的細胞亞定位。結(jié)果術(shù)后第1天，C組大鼠膽汁TBil、DBil含量均低于A組（均P＜0．05）；術(shù)后第3天，C組大鼠膽汁TBil、DBil含量均低于A組和B組（均P＜0．05）；術(shù)后第5天，3組大鼠膽汁TBil、DBil含量比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0．05）。C組大鼠術(shù)后第1、3天血清AST、ALT水平均高于A組，術(shù)后第1、3、5天血清TBil、DBil含量均高于A、B組（均P＜0．05）。術(shù)后第1、3、5天，C組大鼠Bsep蛋白表達量均低于A組，術(shù)后第3、5天均低于B組（均P＜0．05）；C組Mrp2表達均低于A、B組（均P＜0．05）。肝細胞Bsep蛋白明顯向細胞質(zhì)移位。結(jié)論與正常肝臟相比，硬化肝對缺血耐受能力差，HIRI后硬化肝的膽汁淤積情況更加嚴重。Bsep、Mrp2表達降低以及Bsep蛋白由細胞膜向細胞質(zhì)移位的改變在硬化肝HIRI后膽汁淤積中起了重要作用。

肝缺血-再灌注損傷 肝硬化 膽汁淤積

隨著人們生活方式改變及環(huán)境污染加劇，肝癌和肝內(nèi)膽管結(jié)石的發(fā)病率呈上升趨勢。這些患者多伴有肝硬化，肝葉切除是其有效的外科治療手段。術(shù)中為控制肝斷面的出血，常采用Pringle法阻斷全肝血流（肝門阻斷），肝缺血-再灌注損傷（HIRI）不可避免[1]。動物和臨床實驗研究均證實HIRI后常伴有膽汁分泌減少、膽汁淤積的發(fā)生[2]。硬化肝臟對HIRI敏感、耐受力差，加上后繼的肝葉切除可使殘肝功能失代償，術(shù)后膽汁淤積較正常肝臟嚴重，部分患者可出現(xiàn)急性肝功能衰竭甚至死亡。本研究采用肝硬化大鼠肝門阻斷肝葉切除模型模仿臨床肝硬化患者肝門阻斷肝葉切除術(shù)后膽汁淤積的病理生理過程，通過對膽鹽輸出泵（Bsep）和多耐藥相關(guān)蛋白2（Mrp2）的表達、定位的分析揭示膽汁淤積的發(fā)生機制，為臨床肝硬化患者肝門阻斷肝葉切除術(shù)后膽汁淤積的防治提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠45只，體重（220±20）g，由浙江省實驗動物中心提供。

1.2 試劑和儀器 硫代乙酰胺（TAA，美國Sigma公司），AST、ALT、TBil、DBil生化指標試劑盒（南京建成生物工程研究所），兔抗鼠Bsep一抗、兔抗鼠Mrp2一抗（英國Abcam公司），β-actin（美國Santa Cruz公司），HRP標記二抗（美國Jackson公司），PVDF膜（美國Millipore公司），SDS蛋白裂解液、ECL發(fā)光試劑盒等（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），免疫組織化學試劑盒及DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。COBAS INTEGAR 800全自動生化分析儀（瑞典Roche公司），電泳裝置（美國Bio-Rad公司），低溫冰箱（日本SANYO公司），離心機（德國Eppendoff公司），石蠟切片機（德國Leica公司）。

1.3 動物模型制備 大鼠按隨機數(shù)字表法分為A、B、C 3組，每組15只。參照Li等[3]的方法制作肝硬化大鼠模型，建模成功后參照文獻[4]的方法建立HIRI模型。其中A組為正常大鼠HIRI組，B組為肝硬化大鼠假手術(shù)組，C組為肝硬化大鼠HIRI組。研究時間點為肝缺血30min再灌注后的第1、3、5天。

1.4 膽汁與血清收集 分別于術(shù)后第1、3、5天參照文獻[4]的方法收集各組大鼠膽汁，-20℃保存；采集各組大鼠下腔靜脈血4ml，4℃，3 000r/min離心3min后取上清液，-20℃保存。

1.5 膽汁TBil、DBil與血清TBil、DBil、AST、ALT含量測定 按試劑說明書操作。

1.6 Western blot分析Bsep、Mrp2表達 按SDS蛋白裂解液說明書提取肝組織總蛋白，電泳上樣量為50μg，5%脫脂奶粉常溫封閉1h，兔抗鼠Bsep一抗、兔抗鼠Mrp2一抗、β-actin稀釋濃度分別為1∶500、1∶600、1∶800，二抗?jié)舛葹?∶5 000。

1.7 免疫組織化學分析Bsep的細胞亞定位 將石蠟塊切成4μm厚的切片，脫蠟水化后用0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖液修復，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，5% BSA封閉20min，兔抗鼠Bsep一抗?jié)舛?∶200稀釋后4℃孵育過夜，PBS洗滌后孵育山羊抗兔IgG/HRP聚合物，37℃孵育30min，PBS洗滌后DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明后拍照分析。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組比較采用方差分析，兩組比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠術(shù)后膽汁TBil、DBil水平比較 見表1。

表1 3組大鼠術(shù)后膽汁TBil、DBil水平比較（μmol/L）

由表1可見，與A組相比，C組術(shù)后第1、3天膽汁TBil、DBil水平偏低。與B組相比，C組術(shù)后第1天膽汁中TBil、DBil水平無統(tǒng)計學差異，但在術(shù)后第3天，C組膽汁TBil、DBil水平低于B組。術(shù)后第5天，3組大鼠膽汁TBil、DBil水平比較無統(tǒng)計學差異。

2.2 3組大鼠術(shù)后血清AST、ALT、TBil、DBil水平比較 見表2、3。

由表2、3可見，與A組相比，C組術(shù)后第1、3天血清ALT、AST、TBil、DBil水平均明顯增高，在術(shù)后第5天兩組AST水平比較差異無統(tǒng)計學意義，但是其他指標仍明顯增高。與B組相比，C組在術(shù)后第1、3、5天血清TBil、DBil水平均明顯增高。

表2 3組大鼠術(shù)后血清ALT、AST水平比較（U/L）

表3 3組大鼠術(shù)后血清TBil、DBil水平比較（μmol/L）

2.3 3組大鼠術(shù)后Bsep、Mrp2蛋白表達水平比較 見圖1、表4。

圖1 3組大鼠術(shù)后Bsep、Mrp2蛋白表達水平比較電泳圖

表4 3組大鼠術(shù)后Bsep、Mrp2蛋白表達水平比較

由圖1、表4可見，Western blot結(jié)果顯示術(shù)后第1、3、5天，C組大鼠Bsep蛋白表達水平均明顯低于A組，在術(shù)后第3、5天C組大鼠Bsep蛋白表達水平明顯低于B組。術(shù)后第1、3、5天，C組大鼠Mrp2蛋白表達量變化不明顯，但均低于A、B組，而A組呈先下降后上升的趨勢。

2.4 3組大鼠術(shù)后肝細胞Bsep蛋白的細胞亞定位變化比較 見圖2。

由圖2可見，與A、B組相比，C組Bsep蛋白明顯向細胞質(zhì)移位；而A組和B組雖然存在Bsep蛋白向細胞質(zhì)移位現(xiàn)象，但是在細胞膜上仍存有Bsep蛋白，并在術(shù)后第5天細胞膜上Bsep蛋白表達有所恢復。

3 討論

膽汁的形成和分泌是一個復雜的過程，由肝細胞和膽管上皮細胞共同完成，正常情況下肝細胞分泌75%，膽管上皮細胞分泌25%[5]。與肝細胞相比，膽管上皮細胞對常溫缺血并不敏感，大鼠肝臟常溫缺血2h再灌注后足以使肝細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的破壞，而膽管上皮細胞間的緊密連接和活性仍能維持，很少有膽管上皮細胞的壞死或凋亡[6]。這提示在常溫HIRI后膽汁淤積的發(fā)生過程中，肝細胞的損傷起了主要作用。肝細胞結(jié)構(gòu)、功能的完整至關(guān)重要，如發(fā)生破壞會導致膽汁分泌障礙、膽汁不能正常流入毛細膽管內(nèi)形成膽流。Bsep和Mrp2是肝細胞膽管膜側(cè)重要的膽汁成分轉(zhuǎn)運體[7]，Bsep參與的膽鹽排泌是肝臟膽汁形成的主要過程和限速步驟。

有研究表明鼠HIRI后Bsep表達的下調(diào)導致了毛細膽管膜膽鹽的排泌障礙[8]。本研究結(jié)果顯示Bsep蛋白在HIRI后表達量出現(xiàn)先減后增的趨勢，術(shù)后第5天其表達量逐漸恢復，而硬化肝HIRI后Bsep表達量下降，并且恢復過程緩慢。Bsep蛋白只有表達在細胞膜上才能發(fā)揮作用[9-10]，從免疫組化的結(jié)果看術(shù)后第1、3天都存在Bsep蛋白向細胞質(zhì)移位的現(xiàn)象，術(shù)后第5天，A、B組大鼠肝臟的Bsep蛋白在細胞膜上均有所恢復，而C組大鼠肝細胞膜上的Bsep蛋白依然處于丟失狀態(tài)。這與硬化肝HIRI后膽汁淤積及肝損傷都比正常肝臟嚴重的情況相符[11-12]。

C組Mrp2表達量與A組比較顯著下調(diào)，分析原因可能是由于正常肝臟耐受力較硬化肝強，在硬化肝所能耐受的極限缺血時間里對正常肝臟的損傷有限，不足以明顯影響Mrp2表達。Mrp2表達下調(diào)也可能是造成硬化肝HIRI后膽汁淤積的一個重要原因。

綜上所述，與正常肝臟相比，硬化肝對缺血更加敏感，耐受能力不如正常肝臟，HIRI后硬化肝的膽汁淤積情況更加嚴重。肝硬化大鼠HIRI后Bsep、Mrp2表達減少以及Bsep蛋白由細胞膜向細胞質(zhì)移位在膽汁淤積中起了主要作用。

[1] Jaeschke H．Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning[J]．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2003,284(1):15-26．

[2] Accatino L,Pizarro M,Solis N,et al．Bile secretory function after warm hepatic ischemia-reperfusion injury in the rat[J]．Liver Transpl,2003,9(11):1199-1210．

[3] Li X,Benjamin I S,Alexander B．Reproducible production of thioacetamide-induced macronodular cirrhosis in the rat with nomortality[J]．J Hepatol,2002,36(4):488-493．

[4] 王火平．肝硬化大鼠肝缺血再灌注后Bsep、Mrp2表達變化與膽汁淤積的關(guān)系[D]．寧波大學,2012．

[5] Arrese M,Trauner M．Molecular aspects of bile formation and cholestasis[J]．Trends Mol Med,2003,9(12):558-564．

[6] Doctor R B,Dahl R H,Salter K D,et al．Reorganization of cholangiocyte membrane domains represents an early event in rat liver ischemia[J]．Hepatology,1999,29(5):1364-1374．

[7] Diao L,Li N,Brayman T G,et al．Regulation of MRP2/ABCC2 and BSEP/ABCB11 expression in sandwich cultured human and rat hepatocytes exposed to inflammatory cytokines TNF-α, IL-6,and IL-1β[J]．J Biol Chem,2010,285(41):31185-31192．

[8] 舒明,余秋云,彭承宏,等．鼠肝熱缺血再灌注后Bsep基因的表達及調(diào)控[J]．外科理論與實踐,2007,12(1):63-66．

[9] Baghdasaryan A,Chiba P,Trauner M．Clinical application of transcriptional activators of bile salt transporters[J]．Mol Aspects Med,2014,(37):57-76．

[10] Lam P,Soroka C J,Boyer J L．The bile salt export pump:Clinical and experimental aspects of genetic and acquired cholestatic liver disease[J]．Semin Liver Dis,2010,30(2):125-133．

[11] Kojima H,Nies A T,Konig J,et al．Changes in the expression and localization of hepatocellular transporters and radixin in primary biliary cirrhosis[J]．J Hepatol,2003,39(5):693-702．

[12] Chang P,Hung D Y,Siebert G A,et al．Therapeutic effects and possible mechanisms of a snake venom preparation in the fibrotic rat liver[J]．Dig Dis Sci,2005,50(4):745-752．

Expression of Bsep and Mrp2 in liver of cirrhotic rats with intrahepatic cholestasis after ischemia-reperfusion injury

ObjectiveTo investigate the expression of Bsep and Mrp2 liver of cirrhotic rats with intrahepatic cholestasis after hepatic ischemia-reperfusion injury(HIRI)．MethodsForty five male sprague-dawley rats were randomly divided into 3 groups:normal rats with HIRI(group A),liver cirrhosis rats with sham-operation(group B)and cirrhotic rats with HIRI(group C)．The ischemia time was maintained for 30 min．The direct bilirubin(DBil)and total bilirubin(TBil)levels in bile and the DBil,TBil, AST,ALT level in serum were measured at d1,3,5 after operation．The expression of Bsep and Mrp2 proteins was detected by Western blotting and immunohistochemical method,ResultsThe DBil,TBil levels in the bile of group C were significantly lower than those of group A at d1 after operation(P＜0．05)and significantly lower than those of group A and B at d3(P＜0．05)．There was no significant difference among 3 groups at d5 after operation(P＞0．05)．Serum ALT and AST levels in group C were significantly higher than those in group A and B at d1 and d3(P＜0．05)．Serum TBil and DBil levels in group C were significantly higher than those in group A and B at d1,d3 and d5 after surgery(P＜0．05)．The expression of Bsep in liver cells of group C were significantly lower than that in group A at d1,d3 and d5,and lower than that in group B at d1 and d3．The expression of Mrp2 in group C was significantly lower than that in group A at d1,d3 and d5．Immunohistochemistry showed that Bsep protein was translocated to cytoplasm of liver cells in group C．ConclusionIschemic tolerance of cirrhotic liver is poor and intrahepatic cholestasis after HIRI in liver cirrhosis rats is more serious,which may be associated with the decreasied Bsep and Mrp2 protein expression and the abnormal translocation of Bsep to cytoplasm of liver cells．

Hepatic ischemia-reperfusion injury Cirrhosis Cholestasis

2014-12-04）

（本文編輯：李媚）

浙江省自然科學基金資助項目（Y2080096）

315010 寧波市第二醫(yī)院肝膽外科（舒明），干細胞與再生醫(yī)學實驗室（胡笑蓉、黃左安、黃丹丹、王咖、張順）；江西省九江市第三人民醫(yī)院肝膽外科（王火平）

張順，E-mail：worra123@163.com