郝 琦，華 菲，宋 凡，張 環(huán)，王四旺，謝艷華，孫紀(jì)元＊（1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系天然藥物學(xué)教研室，西安 71002；2.秦巴山區(qū)中藥發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，西安 71002；.西安市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 71000）

鹽酸嗎啉胍片對(duì)小鼠心肌細(xì)胞的毒性研究

郝 琦1，2，華 菲1，2，宋 凡1，2，張 環(huán)3，王四旺1，2，謝艷華1，2，孫紀(jì)元1，2＊（1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系天然藥物學(xué)教研室，西安 710032；2.秦巴山區(qū)中藥發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，西安 710032；3.西安市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 710003）

目的 探究鹽酸嗎啉胍片（ABOB）對(duì)心肌細(xì)胞的毒性。方法 將小鼠隨機(jī)分為鹽酸嗎啉胍片高劑量組（8只）、鹽酸嗎啉胍片低劑量組（8只）、生理鹽水對(duì)照組（8只），給小鼠灌胃給藥7d后，檢測(cè)小鼠血清中肌酸激酶（CK）、腦鈉肽（BNP）、肌鈣蛋白T（CTnT）的水平；HE染色對(duì)心臟、腎臟的病理學(xué)形態(tài)分析。同時(shí)對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)，用MTT法檢測(cè)鹽酸嗎啉胍片對(duì)心肌細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果 與對(duì)照組比較，鹽酸嗎啉胍片高劑量組、鹽酸嗎啉胍片低劑量組的CK水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），BNP和CTnT水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組比較，鹽酸嗎啉胍片高劑量組、鹽酸嗎啉胍片低劑量組的心肌組織切片呈病理樣改變，腎臟組織未見(jiàn)明顯變化；與空白對(duì)照組比較，給藥組心肌細(xì)胞活性受到不同程度的抑制，并隨著給藥劑量的增加，心肌細(xì)胞活性逐漸下降。結(jié)論 鹽酸嗎啉胍片對(duì)心肌細(xì)胞有一定的毒性。

鹽酸嗎啉胍片；肌酸激酶；腦鈉肽；肌鈣蛋白T；心肌細(xì)胞

2014年，全國(guó)多地曝出幼兒園擅自給孩子服用鹽酸嗎啉胍片，導(dǎo)致孩子出現(xiàn)許多不良反應(yīng)，甚至部分幼兒出現(xiàn)心肌酶偏高、心肌炎等癥狀［1］。鹽酸嗎啉胍片又稱病毒靈，縮寫為ABOB。1999年，國(guó)家藥監(jiān)局對(duì)地方標(biāo)準(zhǔn)的鹽酸嗎啉胍片公布停用，理由是效果不確切。鹽酸嗎啉胍片最初是作為治療流感的藥物使用的，后來(lái)才被用來(lái)治療病毒性傳染病。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，鹽酸嗎啉胍片的不良反應(yīng)比較少，毒性作用小［23］。鹽酸嗎啉胍片的作用機(jī)制是抑制病毒的DNA和RNA聚合酶，從而抑制病毒繁殖。但病毒的聚合酶并不與人體完全一樣，抑制或殺滅病毒的藥物常影響人體細(xì)胞的復(fù)制，或通過(guò)其他機(jī)制損傷人體細(xì)胞而產(chǎn)生毒性［4－5］。由于心肌細(xì)胞的再生能力有限，壞死灶常被結(jié)締組織取代產(chǎn)生纖維化。如果鹽酸嗎啉胍片有心肌毒性，甚至造成心肌炎，對(duì)兒童健康損害極大［6－7］。對(duì)鹽酸嗎啉胍片的毒性和不良反應(yīng)的說(shuō)法各專家持不同態(tài)度，鹽酸嗎啉胍片是否會(huì)使孩子的心肌酶指標(biāo)偏高、發(fā)生心肌炎等不良反應(yīng)，已經(jīng)成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。本文通過(guò)體內(nèi)藥物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，探討鹽酸嗎啉胍片對(duì)心肌細(xì)胞的毒性作用［8－9］。

1 儀器與材料

1.1 儀器 移液槍（DT51947型，德國(guó)Eppendorf公司）；酶標(biāo)儀（680型，美國(guó)BIO－RAD公司）；半自動(dòng)生化分析儀（RT9600型，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；超凈工作臺(tái)（SW－CJ－1F型，蘇州惠豐凈化設(shè)備有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（HERACELL 150i型，美國(guó)Thermo Scientific公司）；倒置顯微鏡（CKX41型，日本Olympus公司）；離心機(jī)（L420型，湖南湘儀儀器有限公司）。

1.2 試藥 鹽酸嗎啉胍片（購(gòu)于太原市振興制藥有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H14023483）；生理鹽水（購(gòu)于山東康寧藥業(yè)有限公司，批號(hào)：G13013202）；小鼠肌酸激酶試劑盒、小鼠肌鈣蛋白試劑盒、小鼠腦鈉肽試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；2.5g·L－1胰蛋白酶（ShinyBio公司）；10%的胎牛血清（Hyclone公司）；DMEM／F－12培養(yǎng)基（Hyclone公司）；青鏈霉素（genview公司）；MTT（Sigma公司）；二甲基亞砜（Sigma公司）。

1.3 動(dòng)物 健康雌性昆明種小鼠24只，體質(zhì)量20～25g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（陜）2014－002；1～3d齡的SD大鼠7只，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法

2.1 體內(nèi)藥物實(shí)驗(yàn)

2.1.1 分組與給藥 將小鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，分別為：鹽酸嗎啉胍片高劑量組、鹽酸嗎啉胍片低劑量組和生理鹽水對(duì)照組。給藥劑量按本品臨床成人口服劑量設(shè)計(jì)，采用灌胃給藥，連續(xù)給藥7d，每日給藥時(shí)間相近［10］。

2.1.2 觀察指標(biāo) 給藥前及給藥期間每天稱體質(zhì)量，并按體質(zhì)量調(diào)整給藥量。實(shí)驗(yàn)期間每天觀察小鼠一般狀態(tài)、體征、攝食量、飲水及糞便狀況。發(fā)現(xiàn)有中毒反應(yīng)的動(dòng)物應(yīng)取出單籠飼養(yǎng)，重點(diǎn)觀察，發(fā)現(xiàn)死亡或?yàn)l死動(dòng)物應(yīng)及時(shí)解剖［11］。

2.1.3 心肌損傷檢測(cè)指標(biāo) 采用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)小鼠血清中肌酸激酶、肌鈣蛋白和腦鈉肽水平。全部小鼠眼球取血后將血液靜置20min，以3 000 r·min－1離心15min，取血清，參照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行檢測(cè)［12］。

2.1.4 病理學(xué)切片檢測(cè) 處死小鼠后，立即取出心臟、腎臟，置于冷生理鹽水中洗去血液，濾紙吸干水分，切片厚5μm，固定于100mL·L－1甲醛溶液中，石蠟包埋，HE染色，鏡下觀察。

2.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 體外細(xì)胞培養(yǎng)

2.2.1 新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 所有手術(shù)器械高壓滅菌，玻璃器材均強(qiáng)酸浸泡過(guò)夜，流水沖洗20遍，蒸餾水沖洗2次，烘干，高壓滅菌備用。取7只1～3d齡的SD大鼠，用體積分?jǐn)?shù)75%的冰乙醇浸泡5min，取出，置于培養(yǎng)皿中，剪開(kāi)皮膚，無(wú)菌眼科剪在劍突上一肋處入剪（注意避免剪破消化道預(yù)防污染），在胸骨劍突下稍左側(cè)打開(kāi)胸腔，左手輕輕用力，心臟躍出，用眼科彎鑷取心臟，剪除結(jié)締組織。

將剪下的心臟迅速置于預(yù)冷的不含Ca2＋、Mg2＋的PBS中，反復(fù)沖洗3遍，洗去殘留的血細(xì)胞，將其剪成0.5～1mm3的組織塊，放入錐形瓶中。加入2.5 g·L－1胰蛋白酶，37℃消化10min，棄去第一次消化液，再消化2次，吸取上清液，加入適量含10%的胎牛血清的DMEM／F－12培養(yǎng)基，終止消化，吹打混懸液。用篩網(wǎng)過(guò)濾混懸液，收集濾液。將濾液以800r·min－1離心5min，棄去上清液，加入適量含10%胎牛血清的DMEM／F－12培養(yǎng)基，反復(fù)吹打，制成混懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)24，48和72h的細(xì)胞形態(tài)［13－14］。

2.2.2 鋪板 觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，輕輕晃動(dòng)，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用2.5 g·L－1胰酶消化，待細(xì)胞變圓后，加培養(yǎng)液停止消化，用吸管反復(fù)吹打但不要產(chǎn)生泡沫，將瓶壁的細(xì)胞吹落，吹勻后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，經(jīng)計(jì)算配成3×105個(gè)／mL細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，平行條件下鋪3塊板，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.3 給藥 在超凈工作臺(tái)內(nèi)用DMEM／F－12培養(yǎng)液配制2mg·mL－1母液，稀釋成所需質(zhì)量濃度，藥液質(zhì)量濃度分別為2，0.4，0.08，1.6×10－2，3.2× 10－3，6.4×10－4，1.28×10－4，2.56×10－5，5.12× 10－6，1.024×10－6和2.048×10－7mg·mL－1，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置8個(gè)平行孔。觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞大部分貼壁后，每孔加入100μL藥物，空白孔加入100 μL DMEM／F－12培養(yǎng)液，平行條件下鋪3塊板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.4 MTT法測(cè)定鹽酸嗎啉胍片的細(xì)胞毒性 將分別培養(yǎng)24，48和72h的96孔板取出，每孔加入質(zhì)量濃度為0.5mg·mL－1的MTT 20μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)4h后取出96孔板，棄去孔內(nèi)MTT，每孔再加入150μL二甲基亞砜，震蕩儀上震蕩10min，使孔內(nèi)結(jié)晶充分溶解，在490nm波長(zhǎng)處酶標(biāo)儀檢測(cè)［15－16］。

2.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體內(nèi)藥物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 死亡率與一般情況觀察 給藥期間未發(fā)現(xiàn)有小鼠中毒或死亡，小鼠形態(tài)、攝食、飲水均正常。模型組與對(duì)照組相比，用藥前后體質(zhì)量、攝食量、飲水量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.1.2 小鼠血清中CK、BNP、CTnT的變化 與對(duì)照組相比，鹽酸嗎啉胍片高劑量組、鹽酸嗎啉胍片低劑量組小鼠血清中CK水平增高（P＜0.05），CTnT水平和BNP水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 小鼠血清中CK、BNP、CTnT的變化Tab.1 The change of CK，BNP and CTnT in mice serum

3.1.3 病理學(xué)改變 如圖1所示，小鼠心臟HE染色后，正常對(duì)照組心肌纖維排列整齊，無(wú)心肌纖維的破壞，細(xì)胞間隙正常，無(wú)水腫，心肌細(xì)胞大小無(wú)變化，橫紋清晰，胞核正常；鹽酸嗎啉胍片高劑量組心肌細(xì)胞體積增大、水腫，局灶性心肌橫紋消失，染色淺；鹽酸嗎啉胍片低劑量組胞漿染色較正常略淡，少數(shù)區(qū)域心肌纖維斷裂，部分區(qū)域心肌纖維呈波浪狀。小鼠腎臟HE染色后，正常對(duì)照組腎臟病理切片可見(jiàn)腎皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，系膜區(qū)無(wú)增生及沉積物，各級(jí)腎小管及集合管結(jié)構(gòu)清晰，間質(zhì)未見(jiàn)血管擴(kuò)張、充血；鹽酸嗎啉胍片高劑量組可見(jiàn)腎小球系膜區(qū)增寬，腎血管結(jié)構(gòu)不清；鹽酸嗎啉胍片低劑量組系膜區(qū)無(wú)增生，部分區(qū)域腎小管結(jié)構(gòu)模糊［17］。

圖1 鹽酸嗎啉胍片對(duì)小鼠心臟和腎臟病理切片的影響A.正常對(duì)照組心肌組織（HE，×200）；B.鹽酸嗎啉胍片高劑量組心肌組織（HE，×200）；C.鹽酸嗎啉胍片低劑量組心肌組織（HE，×200）；D.正常對(duì)照組腎臟組織（HE，×400）；E.鹽酸嗎啉胍片高劑量組腎臟組織（HE，×400）；F.鹽酸嗎啉胍片低劑量組腎臟組織（HE，×400）Fig.1 The effects of ABOB on heart and kidney pathological section of miceA.normal control group myocardial tissue（HE，×200）；B.ABOB high dose group myocardial tissue（HE，×200）；C.ABOB low dose group myocardial tissue（HE，×200）；D.normal control group kidney tissue（HE，×400）；E.ABOB high dose group kidney tissue（HE，×400）；F.ABOB low dose group kidney tissue（HE，×400）

3.2 體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

3.2.1 新生大鼠心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的觀察 如圖2所示，培養(yǎng)24h的心肌細(xì)胞已貼壁生長(zhǎng)，貼壁后的細(xì)胞為梭形或三角形，細(xì)胞密度較小，但分裂能力旺盛，部分心肌細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)自發(fā)性搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率較慢，每分鐘僅數(shù)次；培養(yǎng)48h后，心肌細(xì)胞在瓶底鋪展，細(xì)胞體積增大，并伸出偽足，形狀仍以三角形和梭形為主，隨著心肌細(xì)胞不斷分裂增殖，細(xì)胞數(shù)目不斷增多，互相連接成片，搏動(dòng)次數(shù)增加；培養(yǎng)3d后，心肌細(xì)胞形態(tài)趨于成熟，呈梭形或柱狀，細(xì)胞鋪滿整個(gè)皿底，相互接觸，交織成網(wǎng)，形成細(xì)胞單層或細(xì)胞簇，其搏動(dòng)趨向同步化［18－19］。

圖2 不同時(shí)期心肌細(xì)胞形態(tài)A.培養(yǎng)24h的心肌細(xì)胞（×200）；B.培養(yǎng)48h的心肌細(xì)胞（× 400）；C.培養(yǎng)72h的心肌細(xì)胞（×400）Fig.2 Myocardial cell morphology in different periodsA.cultivation 24hof myocardial cells（×200）；B.cultivation 48hof myocardial cells（×400）；C.cultivation 72hof myocardial cells（×400）

3.2.2 鹽酸嗎啉胍片對(duì)心肌細(xì)胞的毒性 如圖3所示，與空白對(duì)照組比較，不同質(zhì)量濃度的鹽酸嗎啉胍片在分別培養(yǎng)24，48和72h后，各給藥組對(duì)心肌細(xì)胞活性顯示不同程度的抑制作用。培養(yǎng)24h，隨著給藥劑量的增加，心肌細(xì)胞活性逐漸下降，與空白組比較，各給藥組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［20］。

圖3 ABOB對(duì)心肌細(xì)胞的毒性注：與對(duì)照組相比＊P＜0.05Fig.3 ABOB on myocardial cell toxicity

4 討論

鹽酸嗎啉胍片主要的不良反應(yīng)是抗膽堿反應(yīng)（便秘、出汗等），這種反應(yīng)只要停藥就會(huì)很快消失，但如果有心臟毒性，甚至造成心肌炎，將造成不可逆的損害。其病情輕重不一，重者可發(fā)生心力衰竭、心源性休克或猝死，疾病遷延日久可轉(zhuǎn)化為擴(kuò)張型心肌病。

近期，由于幼兒園違規(guī)長(zhǎng)期給孩子喂藥事件，鹽酸嗎啉胍片引起社會(huì)高度關(guān)注。鹽酸嗎啉胍片的毒性和不良反應(yīng)成為被關(guān)注的熱點(diǎn)。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，鹽酸嗎啉胍片毒性小，不良反應(yīng)相對(duì)較少。相關(guān)專家指出，國(guó)內(nèi)醫(yī)院特別是綜合醫(yī)院有關(guān)兒童的心肌酶譜測(cè)定，都是參照成人心肌酶的正常值標(biāo)準(zhǔn)，按照兒科專家的臨床經(jīng)驗(yàn)，年齡越小的兒童，檢測(cè)的心肌酶值越高，并且影響心肌酶譜的因素較多，如感染、進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良等。不能因?yàn)閮和男募∶冈龈呔驼J(rèn)為是心肌損害，還應(yīng)結(jié)合臨床癥狀、體征和其他檢查結(jié)果進(jìn)行綜合診斷［21］。

本文先進(jìn)行了體內(nèi)藥物實(shí)驗(yàn)，按本品臨床用藥預(yù)防2～3d設(shè)計(jì)，對(duì)小鼠灌胃給藥7d，以CK、BNP、CTnT作為心肌損傷標(biāo)志物，一旦小鼠心肌受損，心肌損傷標(biāo)志物將從受損的心肌釋放到血液中，在血液中的含量相對(duì)升高。本研究結(jié)果表明，CK的水平顯著性增高，BNP和CTnT的水平?jīng)]有明顯變化；進(jìn)一步觀察心肌組織病理切片發(fā)現(xiàn)，鹽酸嗎啉胍片高劑量組的心肌細(xì)胞體積增大，部分區(qū)域心肌纖維橫紋消失，鹽酸嗎啉胍片低劑量組部分區(qū)域心肌纖維呈波浪狀；最后進(jìn)行體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，用MTT法對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)量濃度、作用時(shí)間、給藥劑量等優(yōu)化選擇，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)24h的心肌細(xì)胞隨著給藥劑量的增加，細(xì)胞活性逐漸下降；與空白對(duì)照組比較，各給藥組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，初步認(rèn)為鹽酸嗎啉胍片對(duì)心肌細(xì)胞有一定的毒性。

本實(shí)驗(yàn)采用體內(nèi)和體外分別對(duì)鹽酸嗎啉胍片的心肌毒性進(jìn)行了初步研究，為了進(jìn)一步驗(yàn)證鹽酸嗎啉胍片的心肌毒性及相關(guān)毒性和不良反應(yīng)，還需要進(jìn)行深入研究。

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The toxic effects of Moroxydine Hydrochloride Tablets on mice myocardial cells

HAO Qi1，2，HUA Fei1，2，SONG Fan1，2，ZHANG Huan3，WANG Siwang1，2，XIE Yanhua1，2，SUN Jiyuan1，2＊（1.Department of Natural Medicine，School of Pharmacy，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China；2.Collaborative Innovation Center for Chinese Medicine in Qinba Mountains，Xi′an 710032，China；3.Department of Cardiovascular Medicine，Xi′an Central Hospital，Xi′an 710003，China）

Objective To explore the myocardial cell toxicity of Moroxydine Hydrochloride Tablets（ABOB）.Methods Mice were randomly divided into ABOB high dose group（8），low dose group（8），and saline control group（8）.Mice serum creatine kinase（CK），brain natriuretic peptide（BNP），CTnT levels were determined 7dafter intragastric administration.The hearts and kidneys were removed and processed for histological examination.At the same time，the inhibition effect of ABOB on the newborn rat myocardial cell was evaluated by MTT assay.Results Compared with the control group，ABOB high dose group，ABOB low dose group significantly increased the levels of CK（P＜0.05），while no obvious change was observed in the levels of BNP and CTnT.Compared with the control group，ABOB high dose group and ABOB low dose group，myocardial tissue presented patholoical change，while no obvious change found in kidney tissue.Compared with the control group，myocardial cell activity was inhibited in different degrees after administration of ABOB with high or low dose，and tended to decline gradually with increasing the drug dose.Conclusion ABOB has certain toxicity for myocardial cells.

ABOB；CK；BNP；CTnT；myocardial cells

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.017

R965

A

1004－2407（2015）04－0379－04

2014－11－10）

郝琦，女，藥師

＊通信作者：孫紀(jì)元，男，副教授，碩士生導(dǎo)師