沈鵬 謝永紅 陳林龍

●檢測診斷

人類半翼基因在宮頸癌、宮頸上皮內瘤變組織中的表達及其意義

沈鵬 謝永紅 陳林龍

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。目前臨床宮頸癌早期篩選的檢測標記物主要有人乳頭狀病毒脫氧核糖核苷酸（HPV-DNA）和pl6INK4a，但都存在一定的局限性[1-5]，因此選擇新的生物標記物來提高宮頸癌篩查的敏感度和特異度迫在眉睫。已有研究表明，正常宮頸、宮頸上皮內瘤變Ⅰ級（CINⅠ）、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌組織中,人類半翼基因（hWAPL）陽性表達率呈逐漸升高趨勢，hWAPL與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展有著密切關系。為探索hWAPL基因表達在宮頸上皮內病變篩查中的作用，我們研究了各級宮頸上皮內瘤變及宮頸癌組織中hWAPL的表達及其與宮頸細胞學結果之間的關系，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2010年1至10月海寧市婦幼保健院宮頸手術標本90例，患者年齡28～58（43.07±8.48）歲。病理學診斷：鱗癌（SCC）17例，CINⅢ26例，CINⅡ32例，CINⅠ11例，正常對照4例（為同期因良性疾病而行陰道鏡檢并同時行子宮切除的宮頸組織）。細胞學類型：高度鱗狀上皮內病變（HSIL）34例，低度鱗狀上皮內病變（LSIL）8例，意義不明確的非典型鱗狀上皮細胞（ASCUS）15例，不排除高度病變的非典型鱗狀上皮細胞（LASC-H）28例，無上皮內病變或惡性腫瘤細胞（NILM）5例。所有患者術前均未行放化療，取材后立即用4%甲醛溶液（0.01mol/L PBS）固定12h，石蠟包埋備用。

1.2 主要試劑 兔抗人hWAPL多克隆抗體 (加拿大Novus公司產(chǎn)品)；免疫組化PV-9000試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司產(chǎn)品）。

1.3 免疫組化法檢測hWAPL蛋白表達 組織塊4%甲醛溶液固定后，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度5μm。60℃烤片15min后，常規(guī)方法脫蠟，0.01mol/L PBS振洗3次，每次3min；切片放入3%H2O2中，37℃孵育15min以滅活內源性過氧化物，0.01mol/L PBS振洗3次，每次5min。將切片浸入0.01M枸椽酸鈉緩沖液中，微波爐加熱至沸騰，冷卻后0.01mol/L的PBS振洗3次，每次3min。山羊血清室溫封閉切片5min后，0.01mol/L PBS振洗2次，加1∶100的一抗（兔抗人hWAPL多克隆抗體，陰性對照加0.01mol/L的PBS），于37℃在濕盒內孵育1h，然后置于4℃冰箱孵育過夜。切片滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，在37℃孵育20min，0.01mol/L PBS振洗3次，每次5min。接著進行DAB顯色：切片滴加1～2滴顯色劑，染色15min，雙蒸水沖洗終止反應。自來水充分沖洗，蘇木素輕度復染細胞核（染色時間在1min以內）。切片依次行蒸餾水、75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明。用中性樹膠封片。閱片，拍照，病理圖文定量分析。

1.4 結果判定標準 采用顯色強度結合陽性細胞百分比法判讀結果[1-2]。以細胞胞質或胞核內出現(xiàn)棕黃色顆粒計3分，出現(xiàn)黃色顆粒，計2分，出現(xiàn)淡黃色顆?；驘o黃色顆粒出現(xiàn)，分別計1分或0分。hWAPL染色陽性細胞為細胞質內深棕色顆粒，以積分≥3分為陽性表達病例。高倍視野下計數(shù)上皮細胞與陽性細胞總數(shù)，計算陽性細胞率（陽性細胞率=陽性細胞數(shù)/上皮細胞總數(shù)×100%）：陽性細胞率為6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，≥76%為4分。以顯色強度分值與陽性細胞率分值的乘積作為最后得分（染色強度）。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，測得計量資料采用表示，多組比較采用方差分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 90例標本中hWAPL蛋白的表達與細胞學類型之間的關系 見表1。

表1 90例標本中hWAPL蛋白的表達與細胞學類型之間的關系

由表1可見，HSIL、LSIL、ASCUS、ASC-H各組的表達強度均明顯高于NILM組（P＜0.05）；在HSIL組明顯高于LSIL組（P＜0.05）；在需要排他性診斷的ASCUS和ASC-H組表達強度也明顯高于LSIL組（P＜0.05）；而ASCUS、ASC-H和HSIL組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 不同細胞學類型中hWAPL表達染色強度與宮頸組織學級別之間的關系 見表2。

表2 不同細胞學類型中hWAPL表達染色強度與宮頸組織學級別之間的關系

由表2可見，在ASCUS細胞類型中，SCC+CINⅢ組hWAPL染色強度明顯大于CINⅡ+CINⅠ+慢性宮頸炎組（P＜0.05）。

3 討論

我們前期研究證實hWAPL基因表達強度與組織學結果之間具有密切關系，該結果與國內外的研究結果一致[6-7]。Oikawa等[6]采用實時定量PCR技術對腫瘤及正常組織中的hWAPL基因的mRNA水平進行了檢測，結果表明hWAPL在宮頸癌組織中的mRNA表達水平顯著高于其在正常宮頸組織組以及子宮內膜癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、腎癌和結腸癌的表達，提示hWAPL在宮頸癌組織中具有特異性高表達的特征。國內魯笑欽等[7]應用免疫組化方法對27例正常宮頸、47例宮頸癌及238例其他8種癌組織的hWAPL基因的表達情況進行檢測，實驗發(fā)現(xiàn)，正常宮頸和宮頸癌組織中hWAPL基因陽性表達率分別為33.70%、97.87%。 hWAPL基因在胃癌、肝癌、子宮內膜癌、腎癌、直腸癌、肺癌中呈陰性表達；在膀胱癌和食管癌中，僅有部分樣本呈弱陽性表達。因此，hWAPL表達強度反映了宮頸組織學病變的程度，顯示了hWAPL作為一種新的生物標記物診斷宮頸疾病的可能性。另外，前期的研究也表明，hWAPL表達與pl6Ink4a有較好的相關性，并顯示出對低級別宮頸上皮內瘤變具有良好的診斷價值。因此，象pl6Ink4a一樣，本研究將進一步探討hWAPL在細胞學診斷中的指導價值。

本研究顯示，hWAPL基因表達強度與細胞學結果之間存在一定關聯(lián)性。按不同細胞學結果分組，hWAPL在HSIL、LSIL組的表達強度均明顯高于NILM組的表達（均P＜0.05），而且在HSIL組的表達強度也明顯高于LSIL組的表達（P＜0.05）。上述結果表明hWAPL基因表達的強度與HSIL、LSIL和NILM之間的病變程度相關。

ASCUS和ASC-H是兩種還不甚明確、需要進一步進行排他性診斷的結果，在實際操作中一直較具爭議。本研究中我們發(fā)現(xiàn)ASCUS和ASC-H兩組中所包含的SCC和CINⅢ病變均超過了該組病例數(shù)的50%以上。我們研究還發(fā)現(xiàn)，hWAPL在SCC+CINⅢ組的表達強度顯著高于其在CINⅡ+CINⅠ+慢性宮頸炎組中的表達，結果提示hWAPL表達強度與ASCUS中的高級別病變程度具有相關性。

綜上所述，hWAPL基因表達強度與HSIL、LSIL和NILM之間的病變程度相關；hWAPL表達強度對進一步診斷ASCUS中的高級別病變具有一定的參考價值。

[1]Shin EK,Lee SR,Kim M K,etal.Immunocytochem icalstaining of p16(ink4a)p rotein as an ad junct test in equivocal liquid-based cytology[J].Diagn Cytopathol,2008,36(5):311-316.

[2]Samama B,Schaeffer C,Boehm N.P16 exp ression in relation to human papillomavirus in liquid-based cervical smears[J].GynecolOnco l,2008,109(2):285-290.

[3]Benevolo M,Vocaturo A,Mottolese M,etal.Clinical ro le of p16INK4a exp ression in liquid-based cervical cytology:corre lation with HPV testing and histolog ic d iagnosis[J].Am J Clin Pathol, 2008,129(4):606-612.

[4]Nassar A,O'Reilly K,Cohen C,et al.Com parison of p16INK4A and Hyb rid Cap ture 2 hum an pap illomavirus testing as ad junctive tests in liquid-based gynecologic SurePath p reparations[J].Diagn Cytopathol,2008,36(3):142-148.

[5]Monsonego J,PolliniG,Evrard M J,etal.P16(INK4a)imm unocytochem istry in liquid-based cytology sam p les in equivoca l Pap smears:added value in management of wom en with equivocal Pap smear[J].Acta Cytol,2007,51(5):755-766.

[6]Oikawa K,OhbayashiT,Kiyono T,eta l.Exp ression o fa nove lhum an gene,hum an wings apart-like(hWAPL),is associated w ith cervical carcinogenesis and tumor p rog ression[J].Cancer Res, 2004,64(10):3545-3549.

[7]魯笑欽,崔金全,胡濱,等.宮頸癌組織中hWAPL蛋白的特異性表達[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2008,43(6):1156-1159.

2014-10-28）

（本文編輯：沈昱平）

浙江省公益技術研究社會發(fā)展項目（2012C33059）

314400海寧市人民醫(yī)院外科（沈鵬）；海寧市婦幼保健院病理科（陳林龍）；嘉興學院病理學教研室（謝永紅）

沈鵬，E-mail：394410508@qq.com