喻晴 樓向明

子癇前期患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的改變及意義

喻晴 樓向明

目的鉬探討子癇前期患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）亞群改變及在PE免疫耐受失衡中的作用。方法鉬選取PE患者（觀察組）30例，同期正常晚期妊娠（對照組）20例。分別采集PE患者和正常晚期妊娠婦女外周血，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg以及活化記性相關(guān)（CD45RO、HLA-DR）、歸巢相關(guān)（CCR4、CCR6、CD103）、功能相關(guān)（ICOS、CTLA-4、Galectin 1）和生存相關(guān)（PD1和CD95）標(biāo)記分子的表達(dá)。采用免疫抑制實驗檢測外周血中Treg的免疫抑制功能。 結(jié)果 觀察組患者外周血CD4+CD25+細(xì)胞的比例[(5.87±3.34)%]低于對照組[（6.65±1.18）%]，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。免疫抑制實驗顯示觀察組患者外周血中Treg對CD4+CD25-T細(xì)胞的增值抑制作用與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。通過對Treg多個標(biāo)記分子的檢測進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，ICOS和CCR6在觀察組Treg上的表達(dá)水平顯著低于對照組Treg（均P＜0.01）；CCR4和Galectin 1的表達(dá)水平較對照組低，而CD45RO、HLA-DR、CD103、CTLA、PD1和CD95的表達(dá)水平較對照組高，但兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論 Treg亞群比例失調(diào)可能是導(dǎo)致子癇前期發(fā)生的重要因素。

子癇前期 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 ICOS CCR6

子癇前期（pre-eclampsia，PE），又稱先兆子癇，是指妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓≥140mmHg和（或）舒張壓≥90mmHg伴蛋白尿≥0.3g/24h，或隨機(jī)尿蛋白（+）[1]。PE是孕婦和圍生兒發(fā)病和死亡的主要原因之一，全球發(fā)病率高達(dá)7%～10%，發(fā)病機(jī)制尚不明確。自1976年James提出PE免疫適應(yīng)不良學(xué)說后，有不少研究者認(rèn)識到免疫系統(tǒng)的異常激活在病因?qū)W中起到的重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是最重要的免疫抑制細(xì)胞，能在體內(nèi)和體外抑制其它免疫細(xì)胞 [如CD4+和CD8+T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK）和自然殺傷T細(xì)胞（NKT），B細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞（APCs）]的活化、增生和效應(yīng)功能[2]。既往研究表明，PE患者外周血Treg表達(dá)下調(diào)，造成母胎免疫失衡而導(dǎo)致PE發(fā)生[3]。近年來，隨著對Treg認(rèn)識的深入，發(fā)現(xiàn)Treg可表達(dá)大量的分子標(biāo)記。這些標(biāo)記分子根據(jù)其作用不同可歸納為5類：轉(zhuǎn)錄因子、活化記性相關(guān)（CD45RO、HLA-DR）、歸巢相關(guān)（CCR4、CCR6、CD103）、功能相關(guān)（ICOS、CTLA-4、Galectin 1）和生存相關(guān)（PD1和CD95）標(biāo)記分子[4]。有學(xué)者根據(jù)Treg某些分子標(biāo)記的表達(dá)與否，進(jìn)一步將Treg分為不同亞群。本研究觀察子癇前期患者外周血Treg亞群改變，旨在進(jìn)一步探討Treg在PE發(fā)生過程中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象和分組 2013年5至12月杭州市第一人民醫(yī)院產(chǎn)科收治的PE患者30例（觀察組）；年齡22～30（26.6±2.9）歲；孕34～40（37.4±3.7）周；診斷標(biāo)準(zhǔn)；PE為妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓≥140mmHg和（或）舒張壓≥90mmHg伴蛋白尿≥0.3g/24h，或隨機(jī)尿蛋白（+），具體參照謝幸主編第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》中的標(biāo)準(zhǔn)，所有對象均為剖宮產(chǎn)。既往均無高血壓、糖尿病、甲亢等病史，無其他妊娠合并癥及并發(fā)癥，無傳染病病史。選擇同期產(chǎn)前檢查正常的晚期妊娠婦女20例為對照組，年齡23～30（27.4±3.2）歲；孕35～40（37.9±3.1）周；兩組年齡及孕周比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 主要試劑 PE標(biāo)記的小鼠抗人熒光抗體：CCR6、CTLA-4、ICOS、Galectin-1、PD1和CD95；FITC標(biāo)記的小鼠抗人熒光抗體：CD4、HLA-DR、CD103；APC標(biāo)記的小鼠抗人熒光抗體：CD25；PECY7標(biāo)記的小鼠抗人熒光抗體：CD4、CD45RO、CCR4。上述抗體以及Cytofix/Cytoperm破膜劑均購自美國BD PharMingen公司。CD4+CD25+Treg分離試劑盒購自德國美天旎公司。

1.3 實驗方法 采集兩組孕婦外周血，各10ml肝素抗凝。

1.3.1 外周血單核淋巴細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分離 將肝素抗凝的外周血加在與血液等量的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液上，行密度梯度離心（500g×20min，溫度10℃）；收集單個核細(xì)胞層細(xì)胞，加1～2倍量的PBS液，混勻后離心200g×10min，去上清液；PBS液洗滌細(xì)胞2次后，再用含10%小牛血清的PBS液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度，等待檢測。

1.3.2 細(xì)胞表面及胞內(nèi)染色以及檢測 在每個流式上樣管中加入100μl準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度約為1×106cells/ml，分別加入熒光抗體各20μl，4℃避光孵育30min；加1ml PBS洗滌1遍；如行胞內(nèi)染色，在完成胞外染色后，需加破膜劑1ml室溫孵育20min，PBS洗滌后在加入再加入熒光抗體20μ1，4℃避光孵育30min，PBS洗細(xì)胞1次，然后加100μl PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.3.3 免疫抑制實驗 采用CD4+CD25+Treg分離試劑盒，按照公司說明書，從PBMCs中分離獲得CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T細(xì)胞。在96孔板中，每孔加入2.5×104個Treg，然后按不同比例的接入CD4+CD25-T細(xì)胞（Treg：CD4+CD25-T細(xì)胞=0∶1、0.5∶1和1∶1，每組設(shè)3復(fù)孔），再加入抗CD3（2.5μg/m）和CD28抗體（5μg/ml）共同孵育。4d后加入[3H]胸苷（每孔0.5μCi）再孵育16h。收集細(xì)胞并通過閃爍計數(shù)器計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，測得計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦外周血中CD4+CD25+Treg的比例 見圖1。

圖1 兩組孕婦外周血中CD4+CD25+Treg的比例（A：兩組孕婦外周血中CD4+/CD4+CD25+流式細(xì)胞圖；B：兩組Treg在CD4+T細(xì)胞中的比例圖）

由圖1可見，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示對照組外周血中Treg比例為（5.87±3.34）%，低于觀察組的（6.65±1.18）%，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。2.2 免疫抑制實驗檢測Treg對CD4+CD25-T細(xì)胞增殖抑制的情況 見圖2。

由圖2可見，外周血中Treg免疫抑制功能的研究發(fā)現(xiàn)，兩組Treg對CD4+CD25-T細(xì)胞的增值均有顯著的抑制作用，且呈濃度依賴性；雖然對照組外周血中Treg的免疫抑制能力強(qiáng)于觀察組來源的Treg，但是兩者間無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Treg上ICOS、CCR6、CCR4和Galectin 1的表達(dá)情況 見圖3。

由圖3可見，觀察組外周血Treg上ICOS和CCR6的表達(dá)顯著低于對照組（均P＜0.01），觀察組外周血Treg上CCR4和Galectin 1的表達(dá)低于對照組，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 免疫抑制實驗檢測Treg對CD4+CD25-T細(xì)胞增殖抑制的情況

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Treg上ICOS、CCR6、CCR4和Galectin 1的表達(dá)情況[觀察組（實線，黑柱體），對照組（虛線，白柱體），**P＜0.01]

2.4 兩組孕婦外周血Treg上分子標(biāo)記檢測結(jié)果比較 見表1。

表1 兩組孕婦外周血Treg上分子標(biāo)記檢測結(jié)果比較

由表1可見，觀察組外周血Treg上ICOS和CCR6的表達(dá)顯著低于對照組（均P＜0.01），結(jié)果與圖3相同。CD45RO、HLA-DR、CD103、CTLA-4、PD1和CD95的表達(dá)水平較對照組高，但兩組間差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

Treg是一類免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，在維持自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用，是1995年由Sakaguchi等[5]首次報道后引起廣泛關(guān)注的。它是CD4+T細(xì)胞的一個獨特亞型，在胸腺中產(chǎn)生，以成熟狀態(tài)釋放到外周血中，在自身免疫性疾病的發(fā)生、外周T細(xì)胞的自身穩(wěn)定以及免疫移植中起著重要的作用。CD4+CD25+Treg的兩大功能特征是免疫抑制和免疫無能。近些年的研究表明，在妊娠的各個時期，母體的外周血、蛻膜中都有CD4+CD25+Treg的存在，提示CD4+CD25+Treg在PE的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。既往有學(xué)者報道PE孕婦外周血中CD4+CD25+Treg與正常妊娠孕婦相比無統(tǒng)計學(xué)差異[6]；也有報道PE孕婦外周血中CD4+CD25+Treg顯著低于正常妊娠孕婦[7]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫功能抑制實驗證實，兩組孕婦Treg的表達(dá)和功能均無統(tǒng)計學(xué)差異，與部分文獻(xiàn)報道不一致[3，7]。其最主要原因在于鑒定Treg標(biāo)記物的不同。轉(zhuǎn)錄因子FoxP3是控制Treg發(fā)展和功能的關(guān)鍵分子，是鑒定Treg的一個特異標(biāo)志。

目前已知，Treg表面可表達(dá)各種標(biāo)記分子，并對Treg的活化、記憶、組織定位及生存等多個方面都產(chǎn)生重要影響，從而在很大程度上決定了體內(nèi)Treg的功能發(fā)揮?？烧T導(dǎo)共刺激分子（ICOS）是CD28家族的第3個成員。最新研究表明ICOS在CD4+CD25+Treg表達(dá)與其免疫抑制功能相關(guān)。Ito等[8]根據(jù)ICOS的不同表達(dá)，將Treg分為ICOS+Treg和ICOS-Treg兩個不同的細(xì)胞亞群。ICOS+Treg不僅高表達(dá)和免疫抑制相關(guān)的因子，如IL-10、TGF-β和IL-35，還表達(dá)大量和凋亡相關(guān)的Fas-FasL及顆粒酶B，這些均使ICOS+Treg較ICOS-Treg有更強(qiáng)的免疫抑制功能。最近，通過對腫瘤患者的研究顯示，ICOS+Treg主要集中在腫瘤浸潤淋巴結(jié)中，而ICOSTreg則主要分布在患者外周血中。本研究分析了PE孕婦外周血Treg表面ICOS的表達(dá)，結(jié)果顯示PE孕婦外周血Treg表面ICOS表達(dá)水平顯著低于正常妊娠孕婦，提示ICOS+Treg比例下調(diào)是導(dǎo)致PE發(fā)生的更為確切的因素。

另一方面，Treg免疫抑制功能的發(fā)揮除了由其自身能力決定外，還與Treg在組織內(nèi)的定位密切相關(guān)[9]。而Treg表面的趨化因子受體是決定其組織定位的關(guān)鍵因素。Treg細(xì)胞表面可表達(dá)多種趨化因子受體，如CCR4、CCR6和CCR7等。CCR4被證實主要與Treg向腫瘤組織遷移相關(guān)[9-10]。而最新研究發(fā)現(xiàn)，CCR6也可介導(dǎo)Treg向多種腫瘤組織遷移[11-12]。更為重要的是，CCR6還與Treg向炎癥組織遷移密切相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)PE孕婦外周血Treg表面CCR6表達(dá)顯著低于正常妊娠孕婦，提示PE孕婦外周血中通過CCR6介導(dǎo)進(jìn)入胎盤蛻膜組織中的Treg顯著少于正常妊娠孕婦，進(jìn)而可能增加PE發(fā)生的概率。

綜上所述，本研究結(jié)果提示CD4+CD25+Treg亞群比例失調(diào)可能是導(dǎo)致Treg相關(guān)PE發(fā)生的更為確切的機(jī)制。本研究結(jié)果可為PE的免疫平衡療法提供新的靶點。

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（本文編輯：沈昱平）

《浙江醫(yī)學(xué)》對計量單位的要求

本刊執(zhí)行GB 3100～3102-1993《量和單位》中有關(guān)量、單位和符號的規(guī)定及其書寫規(guī)則，具體執(zhí)行可參照中華醫(yī)學(xué)會雜志社編寫的《法定計量單位在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用》。注意單位名稱與單位符號不可混用。組合單位符號中表示相除的斜線多于1條時應(yīng)采用負(fù)數(shù)冪的形式表示，組合單位中斜線和負(fù)數(shù)冪亦不可混用，如ng/kg/min應(yīng)采用ng·kg-1·min-1的形式，不宜采用ng/kg-1·min-1的形式。在敘述中應(yīng)先列出法定計量單位數(shù)值，括號內(nèi)寫舊制單位數(shù)值；如果同一計量單位反復(fù)出現(xiàn)，可在首次出現(xiàn)時注出法定與舊制單位換算系數(shù)，然后只列法定計量單位數(shù)值。血壓仍以mmHg表示。

本刊編輯部

Changes of regulatory T cells in peripheral blood of patients w ith preeclampsia

YU Qing,LOU Xiangming.Department of Obstet-rics and Gynecology,Hangzhou Obstetrics and Gynecology Hospital,Hangzhou 310008,China

Objective To investigate the changes of regulatory T cells(CD4+CD25+Treg)in peripheral b lood of patients w ith p reec lampsia(PE).Methods Peripheralb lood of30 patients w ith PE and 20 normalg ravidas w ith late p regnancy were enrolled.The exp ression of CD4+CD25+Treg and its markers related to activation(CD45RO,HLA-DR),hom ing(CCR4,CCR6, CD103),func tion(ICOS,CTLA-4,Galectin 1)and survival(PD 1 and CD95)were detected using flow cytometry.Immunosupp ression function of Treg in vitro was detected by immunosupp ression assay,Results The p roportion of CD4+CD25+Treg among CD4+T cells was 5.87±3.34%in patients w ith PE,lower than that in controlgroup(6.65±1.18%,P＞0.05).Immunosupp ression assay showed sim ilar supp ression power of Treg from the two groups.The exp ression of ICOS and CCR6 on Treg in patients w ith PEwas significantly lower than that in normalp regnancy sub jects(P＜0.01).The exp ression of CCR4 and Galectin 1 was decreased but that of CD45RO,HLA-DR,CD103,CTLA,PD1 and CD95 was inc reased in patients w ith PE.However,the d ifferences between the two g roups were not significant.Conclusion Imbalance of Treg subsets may be an important fac tor leading to the occurrence ofp reec lam psia.

Preec lam psia Regulatory T cell ICOS CCR6

2014-04-07）

310008杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院婦產(chǎn)科