王飛達(dá) 王兆洪 張躍 童洪飛 王向昱 王繼生

●論 著

鴉膽子素D對人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1體外增殖的抑制作用

王飛達(dá) 王兆洪 張躍 童洪飛 王向昱 王繼生

目的鉬探討鴉膽子素D對人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1體外增殖的影響。方法鉬人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1經(jīng)不同濃度（0、5、10、20、40、60μmol/L）鴉膽子素D分別作用24、48、72 h后，應(yīng)用CCK-8法檢測鴉膽子素D對Panc-1細(xì)胞的增殖抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測Panc-1細(xì)胞凋亡情況；Western b lot檢測Panc-1細(xì)胞經(jīng)0、5、10、20、30、60μmol/L的鴉膽子素D處理24h后以及20μmol/L的鴉膽子素D處理24、48、72 h后，細(xì)胞中Bax及Bc l-2的表達(dá)。結(jié)果 鴉膽子素D對Panc-1細(xì)胞的增殖抑制作用呈明顯濃度和時間依賴性，60μmol/L時對Panc-1作用24、48、72 h后細(xì)胞存活率分別為54.44%、33.00%、21.63%，凋亡率分別為47.29%、63.80%、72.16%；0、5、10、20、30、60μmol/L的鴉膽子素D作用于Panc-1細(xì)胞72h后的細(xì)胞存活率是100%、71.60%、60.37%、46.78%、39.98%、21.63%，凋亡率分別為0、26.63%、45.62%、56.18%、62.21%、72.16%；隨著鴉膽子素D作用時間的延長或濃度的增加Bax蛋白的表達(dá)升高，Bc l-2蛋白的表達(dá)降低。結(jié)論 鴉膽子素D可顯著抑制人胰腺癌Panc-1細(xì)胞生長，并促進(jìn)其凋亡，在一定的濃度和時間范圍內(nèi)，其作用呈明顯濃度和時間依賴性，其作用機制可能是通過促進(jìn)Bax的表達(dá)，降低Bc l-2的表達(dá)實現(xiàn)的。

鴉膽子素D胰腺癌 增殖 Bax Bc l-2

胰腺癌由于位置深，起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時已多屬晚期，且病情發(fā)展迅速，治療效果較差。目前以吉西他濱為基礎(chǔ)的化療是治療胰腺癌最主要的內(nèi)科治療手段[1]，國內(nèi)外有許多關(guān)于吉西他濱聯(lián)合用藥治療晚期胰腺癌的試驗，如吉西他濱聯(lián)合順鉑、靶向藥物等治療胰腺癌，在一定程度上能改善胰腺癌的治療效果[2]。近年來中醫(yī)藥抗癌研究取得了重大進(jìn)展，國內(nèi)外已有研究報道大黃素、姜黃素等能顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖[3-4]。有報道表明，鴉膽子素對肝癌、肺癌、乳腺癌等眾多腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用[5]，但其作用機制尚未完全明確。故我們通過研究不同濃度的鴉膽子素D對胰腺癌細(xì)胞生長的影響，探討其可能的作用及其機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要藥品和試劑 鴉膽子素D（純度＞98%），產(chǎn)品批號：Y0001196（美國Sigma公司），用二甲基亞砜（DMSO）配制成0.2m mol/L（DMSO的終濃度＜0.05%）；胎牛血清、胰酶、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒，批號C0038（中國碧云天生物技術(shù)研究所）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒批號TY4681（中國南京凱基生物發(fā)展有限公司）；Bax抗體，批號：1063-1、Bcl-2抗體，批號：1017-1和β-actin抗體，批號：1854-1（Epitomics公司，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞Panc-1（購于美國模式培養(yǎng)物集存庫，ATCC）培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100μ/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于含5%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3d換液1次。細(xì)胞單層貼壁生長，約80%融合時胰蛋白酶消化傳代。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 收集處于對數(shù)生長期的Panc-1胰腺癌細(xì)胞，接種到96孔板，4×103個/孔，細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度鴉膽子素D（0、5、10、20、30、60μmol/L）分別作用24、48、72h，每組重復(fù)5孔。同時設(shè)置空白調(diào)零組（不加細(xì)胞加入等量的PBS）。藥物作用結(jié)束前1h，各孔加入0.01ml CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)1h，酶標(biāo)儀（Bio-Tek，ELX800美國寶特）測定波長450nm處的吸光度值測（A值），實驗重復(fù)3次。細(xì)胞存活率=（實驗組A值－空白調(diào)零A值）/（對照組A值－空白調(diào)零A值）×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-FITC/ PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。將4×105個處于對數(shù)生長期的Panc-1細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中，生長至90%融合時，分別加入不同濃度鴉膽子素D（0、5、10、20、30、60μmol/L）分別作用24、48、72h后，胰蛋白酶消化，1 000r/min離心5min。冷PBS洗2次，按Annexin V-FITC/ PI凋亡檢測試劑盒說明用500μl Binging Buffer重懸細(xì)胞，加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI混勻，室溫避光作用15min上機檢測，檢測細(xì)胞數(shù)為1×104/組。激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm。Cellquest軟件分析。

1.5 Western blot檢測Panc-1胰腺癌細(xì)胞蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá) 收集處于對數(shù)生長期的Panc-1胰腺癌細(xì)胞經(jīng)30μmol/L鴉膽子素D作用24、48、72h后，RIPA裂解液裂解，提取上清液，測量蛋白濃度。取等量蛋白質(zhì)樣品（20μg/孔），8%SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉后滴加兔抗人Bax或者Bcl-2抗體為第一抗體，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為第二抗體，ECL顯色，X線膠片曝光。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，測得計量資料采用表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 鴉膽子素D對Panc-1胰腺癌細(xì)胞增殖的影響 0、5、10、20、30、60μmol/L鴉膽子素D分別作用24h后細(xì)胞的存活率是100%、92.84%、86.50%、80.16%、75.39%、 54.44%；作用48h后細(xì)胞的存活率是100%、76.86%、68.71%、60.87%、50.24%、33.00%；作用72h后細(xì)胞的存活率是 100%、71.60%、60.37%、46.78%、39.98%、21.63%。相同的作用時間，隨著鴉膽子素D濃度的提高細(xì)胞的存活率逐漸降低（P＜0.05）；相同濃度的鴉膽子素D隨時間的延長細(xì)胞的存活率逐漸降低（P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 鴉膽子素D對Panc-1胰腺癌細(xì)胞增殖的影響

2.2 鴉膽子素D對Panc-1胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響 0、5、10、20、30、60μmol/L鴉膽子素D分別作用24h后細(xì)胞的凋亡率是0、11.02%、17.13%、26.51%、35.37%、47.29%；作用48h后細(xì)胞的凋亡率是0、18.13%、29.56%、43.56%、50.26%、63.80%；作用72h后細(xì)胞的凋亡率是0、26.63%、45.62%、56.18%、62.21%、72.16%。相同的作用時間，隨著鴉膽子素D濃度的提高細(xì)胞的凋亡率逐漸升高（P＜0.05）；相同濃度的鴉膽子素D，隨時間的延長細(xì)胞的凋亡率逐漸升高（P＜0.05）。詳見圖2。

圖2 鴉膽子素D對Panc-1胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響

2.3 Western blot檢測Panc-1胰腺癌細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá) 30μmol/L鴉膽子素D對Panc-1胰腺癌細(xì)胞作用0、24、48、72h后，Bax蛋白表達(dá)隨鴉膽子素D作用時間延長而上調(diào)，Bcl-2蛋白的表達(dá)則隨作用時間延長而下調(diào)（見圖3）。0、5、10、20、30、60μmol/L鴉膽子素D對Panc-1胰腺癌細(xì)胞作用24h后，Bax蛋白表達(dá)隨鴉膽子素D濃度增加而上調(diào)，Bcl-2蛋白的表達(dá)則隨濃度增加而下調(diào)（見圖4）。

3 討論

鴉膽子，別名老鴉膽、苦參子，為苦木科植物鴉膽子的干燥成熟果實。臨床上將10%鴉膽子油乳劑用于治療消化系統(tǒng)腫瘤，如胃癌、食管癌、原發(fā)性肝癌、大腸癌、胰腺癌等,效果顯著。有研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子中的一種單體鴉膽子素D能夠誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡[6-7]。本實驗中膽子素D既能抑制胰腺癌Panc-1細(xì)胞增殖，也能夠誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡。相同的作用時間，隨著鴉膽子素D濃度的提高細(xì)胞的存活率降低，凋亡率逐漸升高（P＜0.05）；相同濃度的鴉膽子素D，隨時間的延長存活率降低，凋亡率逐漸升高（P＜0.05）。即鴉膽子素D對胰腺癌的抑制作用有時間和濃度依賴性。

圖3 30μmol/L鴉膽子素D作用Panc-1細(xì)胞后Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)情況

圖4 0、5、10、20、30、60μmol/L鴉膽子素D對Panc-1胰腺癌細(xì)胞作用24 h后，Bax蛋白表達(dá)情況

細(xì)胞的凋亡受多種基因的調(diào)節(jié)，Bcl-2和Bax是Bcl-2家族重要的凋亡調(diào)控基因，通常情況下是以異源二聚體的形式存在的，Bcl-2和Bax與多種腫瘤和非腫瘤病變的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。研究表明，Bcl-2/Bax比例是決定細(xì)胞對凋亡的調(diào)節(jié)有重要作用。當(dāng)比例增高時，細(xì)胞凋亡受到抑制，反之，細(xì)胞易于發(fā)生凋亡。有實驗證明，鴉膽子對胃癌細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，其可能的機制是Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，而Bax蛋白表達(dá)水平升高誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[8]。鴉膽子素D是鴉膽子的主要成分，本實驗結(jié)果顯示Panc-1胰腺癌細(xì)胞受鴉膽子素D作用后Bcl-2蛋白的表達(dá)降低，而Bax蛋白的表達(dá)升高。在本實驗的濃度范圍內(nèi)隨著鴉膽子素D濃度的增高及時間的延長，Bcl-2蛋白表達(dá)也相應(yīng)的降低，Bax蛋白的表達(dá)升高。

本實驗初步證實鴉膽子素D能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，其機制可能是通過改變Bcl-2/ Bax異源二聚體而實現(xiàn)的抗凋亡的。鴉膽子素D對胰腺癌影響的具體機制有待進(jìn)一步研究。

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Brucein D inhibits proliferation and induces apoptosis of PANC-1 pancreatic adenocarcinoma cell line

WANG Feida,WANG Zhao-hong,ZHANG Yue,et al.Department of Internal Chinese Medicine,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou 310012, China

Objective To investigate the effec t of b rucein D(BD)on p roliferation and apop tosis of pancreatic adenocarcinoma cells.Methods Human pancreatic cancer PANC-1 cells were treated with 0,5,10,20,30 and 60μmol/LBD for 24, 48 and 72h.The cellp roliferation was detected by cellcounting kit-8(CCK-8)assay,cellapop tosis was detec ted using Annexin V-FITC/PI.The p rotein exp ressions of Bax and Bc l-2 were detected using Western b lot.Results BD significantly inhibited p roliferation of PANC-1 cells,up-regulated Bax p rotein exp ression and down-regulated Bc l-2 exp ression in a dose-and time-dependentmanner(P＜0.05).Conclusion BD can significantly inhibit the p roliferation and induce apop tosis of PANC-1 cells in vitro,which is associated w ith up-regulation the exp ression of Bax and down-regulation the exp ression of Bc l-2.

Brucein D Pancreatic carcinoma Proliferation Bax Bc l-2

2015-03-05）

（本文編輯：沈昱平）

浙江省溫州市科技局計劃項目（Y20130099）

310012杭州，浙江省立同德醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科（王飛達(dá)）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科（王兆洪、張躍、童洪飛、王向昱、王繼生）

王兆洪，E-mail:wangzhaohong55@163.com