徐道緄 楊海華 錢偉 王微 邊屯

●論 著

O-GIcNAc轉(zhuǎn)移酶在直腸癌中的分布及其對預后的影響

徐道緄 楊海華 錢偉 王微 邊屯

目的 了解O-GIcNAc轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc transferase，OGT)在直腸癌中的表達情況及對預后的影響。 方法 利用免疫組化技術，在直腸癌組織芯片上染色OGT，確定表達情況，并與患者臨床資料結合，了解OGT的表達與直腸癌患者的生存是否有差異。 結果 OGT在直腸癌組織中的表達情況：“-”12.22%、“+”27.78%、“++”44.44%、“+++”15.56%,癌旁組織中的表達情況：“-”18.89%、“+”42.22%、“++”37.78%、“+++”1.11%；癌組織中OGT高表達（++和+++）為60.00%，高于癌旁組織中OGT高標的量38.89%；OGT高表達直腸癌患者的3年生存率分別是82.90%和60.00%，兩者比較有統(tǒng)計學差異（χ2=7.452，P=0.006）。 結論OGT在直腸癌中的表達高于周圍正常組織，直腸癌中高表達的3年生存率較低，OGT可能參加了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。

直腸癌O-GIcNAc轉(zhuǎn)移酶 組織芯片 免疫組化 預后

氧連接的β-N-乙酰葡萄糖胺修飾（O-GlcNAc）是一種廣泛存在于細胞漿和細胞核蛋白質(zhì)絲氨酸和蘇氨酸上的動態(tài)、可逆的翻譯后修飾，與經(jīng)典的糖基化修飾不同，而類似于磷酸化，介導O-GlcNAc基團添加和移除的酶分別是O-GIcNAc轉(zhuǎn)移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）和O-GIcNAc水解酶（O-GlcNAcase，OGA）[1-2]。OGT與腫瘤的發(fā)生可能有密切關系，因為有很多原癌基因和抑癌基因產(chǎn)物都表現(xiàn)OGlcNAc修飾，如c-Myc、p53、Rb等[3-6]。OGT在直腸癌中的表達情況和對預后的影響目前尚無報道，對OGT在直腸癌中的研究不僅有助于人們了解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，同時也可能推動新的腫瘤細胞靶向治療的發(fā)展。

1 資料和方法

1.1 一般資料 人類直腸癌組織芯片購于上海芯超生物科技有限公司（Shanghai Outdo Biotech Co.，Ltd.）。生存期直腸癌180點組織芯片陣列編號HRec-Ade180Sur-02，人類直腸腺癌組織，福爾馬林固定?？偫龜?shù)90例，總點數(shù)180點 (癌及相應癌旁組織各取一點)，點直徑2.0mm，芯片厚度4μm。OGT一抗購買于美國Abcam公司（ab96718）。羊抗兔二抗購買于美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化

1.2.1.1 染色 常規(guī)石蠟切片脫蠟、水化；抗原修復：取檸檬酸鹽緩沖液（pH6．0）煮沸，放入脫蠟水化后的組織切片，加熱維持30min，室溫放置自然冷卻，取出玻片，PBS沖洗5min×3次；3%雙氧水．甲醇溶液浸泡玻片，以消除內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15min，PBS沖洗5min×3次；3%BSA溶液封閉，室溫10min，甩去封閉液；用3%BSA溶液按比例（OGT抗體1∶200）稀釋一抗，4℃濕盒過夜孵育；次日取出后置于室溫，復溫30min，PBS沖洗5min×3次；用3%BSA溶液按1∶11 000稀釋二抗，室溫60min，PBS沖洗5min×3次；新鮮配制的DAB溶液避光顯色，顯微鏡下觀察，自來水沖洗終止顯色；蘇木精復染細胞核，自來水沖洗返藍；組織切片依次經(jīng)過梯度酒精（70%、80%、95%、100%）脫水，二甲苯透明化，中性樹脂封片。

1.2.1.2 染色評分方法 參照Fromowitz standard方法，取五個點的平均值。每個點的OGT強度由染色的強度與范圍相加得到。染色強度分為四個等級：無染色為0，弱染色為1，中度染色為2，強度染色為3；染色范圍分四個等級：0表示0%～25%，1表示26%～50%，2表示51%～75%，3表示76%～100%。芯片上每個點的綜合強度為五個視野的平均值。兩者乘積0～1為-，2～4為“+”，4～6為“++”，7-9為“+++”。低表達為“-”和“+”，高表達為“++”和“+++”[7]。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件。組間計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗。兩組間生存曲線比較采用Log-Rank檢驗。

2 結果

2.1 OGT表達不同患者臨床資料比較 見表1。

由表1可見，OGT表達不同患者臨床資料比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.2 OGT在直腸癌及正常/癌旁組織中的表達情況 見圖1、2。

圖1 OGT在癌旁組織和癌組織中的表達情況

由圖1、2可見，OGT在直腸癌組織中表達分別為“-”12.22%、“+”27.78%、“++”44.44%、“+++”15.56%，正常/癌旁組織中的表達情況分別為“-”18.89%、“+”42.22%、“++”37.78%、“+++”1.11%。

2.3 OGT在直腸癌及正常/癌旁組織中的表達分布比較 見圖3。由圖3可見，OGT在癌組織中OGT高表達（++和+++）為61%，高于正常/癌旁組織中OGT高表達的量（40%）。

表1 OGT表達不同患者臨床資料比較（例）

圖2 OGT在癌組織和正常/癌旁組織中的分布圖

2.4 OGT表達對直腸癌患者生存的影響 見圖4。由圖4可見，OGT高表達和低表達的直腸癌患者3年生存率分別是60.00%和82.90%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.452，P=0.006）。

圖3 OGT在直腸癌及正常/癌旁組織中的表達分布比較

圖4 OGT的表達對直腸癌患者生存的影響

3 討論

編碼OGT的基因在許多生物中都被克隆到，并且高度保守，人和大鼠的OGT有99%的同源性，OGT蛋白包括N端的蛋白質(zhì)靶向信息序列、34氨基酸重復序列(TPR)、連接區(qū)域、和C端的催化結構域。OGT的催化結構域高度保守，很多與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關的蛋白質(zhì)都被證明具有O-GlcNAc修飾，比如核蛋白c-Myc、抑癌蛋白p53、Rb03J、連環(huán)蛋白E-catenin、轉(zhuǎn)錄因子NFATl和NF-KB等。眾多研究結果暗示，O-GlcNAc修飾可能通過調(diào)節(jié)特定的腫瘤相關蛋白的活性，參與影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。

研究證實，癌細胞具有較高的葡萄糖攝入和利用率，并且在癌細胞中可檢測到HBP通路上調(diào)和UDPGlcNAc濃度的升高。HBP通路作為糖酵解的分支之一，其重要意義并不在于提供能量，而是為癌細胞快速增殖提供重要的代謝合成原料，如谷氨酰胺、乙酰輔酶A、UTP等。而UDP-GlcNAc濃度升高，可引起細胞內(nèi)的O-GlcNAc修飾水平上調(diào)[2，10]。此前的研究結果已經(jīng)證明，在乳腺癌和肺癌組織中，O-GlcNAc修飾水平顯著增加[11]。Yang等[12]發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞中O-GlcNAc修飾水平顯著升高，OGT的mRNA和蛋白表達量也增加。本研究發(fā)現(xiàn)，OGT高表達在直腸癌細胞中（60.00%）明顯高于癌旁正常組織（38.89%，P＜0.05），而且在直腸癌組織中OGT高表達的患者3年生存率（60.00%）明顯低于低表達的患者（82.90%，P＜0.05）。這個研究結果進一步表明，OGT修飾對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程可能有重要的影響作用，值得進一步研究其作用機制。

[1] Torres C R,Hart G W.Topography and polypeptide distribution of terminal N-acetylglucosamine residues on the surfaces of intact lymphocytes[J] .J BiolChem,1984,259(5):3308-3317.

[2] Hart G W,Housley M P,Slawson C:Cycling of O-linked beta-N-acetylglucosamine on nucleocytoplasmic proteins[J] .Nature,2007,446(7139):1017-1022.

[3] Chou T Y,Hart G W,Dang C V:c-Myc is glycosylated at threonine 58,a known phosphorylation site and a mutationalhot spot in lymphomas[J] .J BiolChem,1995,270(32):18961-18965.

[4] Yang W H,Kim J E,Nam H W,et al.Cho J W:Modification of p53 with O-linked N-acetylglucosamine regulates p53 activity and stability[J] .Nat CellBiol,2006,8(10):1074-1083.

[5] Zachara N E,Hart G W.O-GlcNAc a sensor of cellular state:the role of nucleocytoplasmic glycosylation in modulating cellular function in response to nutrition and stress[J] .Biochim Biophys Acta,2004,1673(1-2):13-28.

[6] Golks A,Tran T T,Goetschy J F.Guerini D:Requirement for O-linked N-acetylglucosaminyltransferase in lymphocytes activation[J] .EMBO J,2007,26(20):4368-4379.

[7] Fromowitz F B,Viola M V,chao S,et al.Res p21expression in the progression of breast cancer[J] .Humpathol,1987,18:1268-1275.

[8] Sherr C J,McCormick F.The RB and p53 pathways in cancer[J] . Cancer Cell,2002,2(2):103-112.

[9] Kreppel L K,Blomberg M A,Hart G W.Dynamic glycosylation of nuclear and cytosolic proteins.Cloning and characterization of a unique O-GlcNAc transferose with multiple tetratricopeptide repeats[J] .J BiolChem,1997,272(14):9308-9315．

[10] Wice B M,Trugnan G,Pinto M,et al,The intracellular accumulation of UDP-N-acetylhexosamines is concomitant with the inability of human colon cancer cells to differentiate[J] .J Biol Chem,1985,260:139,146．

[11] 葛宇清,顧玉超,于文功.N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶II促進小鼠乳腺癌細胞遷移研究[J] .中國生物工程雜志,2007,27(5):6-10．

[12] Yang X,Zhang F,Kudlow J E.Recruitment of O-GlcNAc transferase to promoters by corepressor mSin3A:coupling protein O-GlcNAcylation to transcriptional repression[J] .Cell,2002, 110(1):69-80.

Expression of O-GIcNAc transferase in rectal cancer and its relation to disease prognosis

XU Daokun,YANG Haihua,QIAN Wei,et al.
Department of Coloretal Surgery,Wenling TCM Hospital,Wenling 317500，China

Objective To investigate the expression of O-GIcNAc transferase(OGT)and its relation to prognosis in rectal cancer. Methods The expression of OGT was detected with immunohistochemical technique on rectal cancer tissue microarray. The association of OGT expression with survival of patients was analyzed. Results The high OGT expression(++and+++) rate in rectal cancer was higher than that in pericancerous tissue(60.0%vs 38.9%,P＜0.05).The 3-years survival rate in patients with high OGT expression was lower than that with low expression(60.0%vs 82.9%,χ2=7.452,P=0.006). Conclusion OGT expression in rectal cancer is higher than that in normal tissue.Rectal cancer patients with high OGT expression may have less favorable prognosis than those with low OGT expression.

Rectal cancer O-GIcNAc transferase(OGT) Tissue microarray ImmunohistochemicalPrognosis

2014-06-30）

（本文編輯：田云鵬）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（2011KY B146）

317500 溫嶺市中醫(yī)院肛腸外科（徐道緄、錢偉、邊屯）；臺州醫(yī)院放療科腫瘤細胞和分子放射生物實驗室（楊海華、王微）