■吳代武 稅典章 蔡春芳 吳 萍 葉元土 彭 侃 羅其剛 林秀秀

（蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院江蘇省水產(chǎn)動物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇蘇州 215123）

鳀魚（Engraulis japonicus）是鳀屬魚類的統(tǒng)稱，鳀 屬魚類產(chǎn)量占世界水產(chǎn)品產(chǎn)量的10%～20%，在我國主要分布在黃海、東海海域[1]，是中國近海魚類中最大的魚類種群資源[2]。鳀魚營養(yǎng)價(jià)值較高，蛋白質(zhì)含量約為15%～20%，必需氨基酸含量豐富[3]，具有較高的開發(fā)價(jià)值。

在魚粉資源日益緊張的情況下，開發(fā)新的飼用產(chǎn)品提高資源的利用效率也是對資源的一種節(jié)約。以新鮮的海水低值魚類為原料生產(chǎn)魚漿用于飼料，在實(shí)際生產(chǎn)中表現(xiàn)出很好的效果，主要特點(diǎn)是維護(hù)了原料魚的蛋白質(zhì)和油脂新鮮度、保持了海水魚類原料對養(yǎng)殖動物生長的優(yōu)勢，同時(shí)也增加了飼料的誘食效果、增加了飼料生產(chǎn)過程中的水分含量。傳統(tǒng)的魚粉生產(chǎn)工藝中，原料魚在蒸煮、烘干等生產(chǎn)環(huán)節(jié)經(jīng)一定的高溫處理，使一些有害成分含量升高[4]。鳀魚體內(nèi)肝胰臟、腸道和細(xì)胞溶酶體中含有豐富的內(nèi)源蛋白酶[5-6]，能將自身蛋白質(zhì)酶解成多肽和氨基酸。有研究表明，鮮雜魚[7]、水解蛋白[8]能有效地促進(jìn)水產(chǎn)動物的生長。如果以冰凍鳀魚為原料，經(jīng)過打漿后酶解而得到魚漿直接用于水產(chǎn)飼料中，避免魚粉生產(chǎn)的高溫對油脂、蛋白質(zhì)的不利影響，可以很好地保持魚漿新鮮度和魚體特殊營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)具有強(qiáng)烈的誘食性。這在部分海水魚類飼料、尤其是肉食性魚類飼料中得到初步的應(yīng)用，取得很好的養(yǎng)殖效果。但是，對酶解過程中生化成分變化的研究還不多。

本試驗(yàn)在55℃條件下，通過外源木瓜蛋白酶促進(jìn)酶解反應(yīng)、抗生素抑制微生物繁殖對鳀魚進(jìn)行酶解。將魚漿冷凍干燥，測定游離氨基酸、揮發(fā)性鹽基氮、生物胺、脂肪酸、丙二醛、過氧化值和酸價(jià)，對酶解過程中的生化變化規(guī)律進(jìn)行研究，為鳀魚內(nèi)源蛋白酶類的利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)分為4個(gè)處理，分別用C、E、A、E+A表示。C：對照組。E：添加外源木瓜蛋白酶5 500 U/g。A：添加抗生素抑制微生物的生長，抗生素的用量為青霉素150 IU/g、鏈霉素150 μg/g，0、5 h各添加1次[9]。E+A：E、A處理中所用的抗生素及木瓜蛋白酶。然后對4個(gè)處理鳀魚在酶解過程中的營養(yǎng)成分變化進(jìn)行分析，與商業(yè)魚粉比較。

1.2 試驗(yàn)鳀魚

鳀魚由山東海圣飼料有限公司提供，為冰凍保存的鳀魚；商業(yè)魚粉由山東海圣飼料有限公司提供；木瓜蛋白酶為廣州鴻易食品添加劑有限公司產(chǎn)品。

選取完整的冰凍鳀魚，用絞肉機(jī)在鳀魚為冰凍狀態(tài)下絞碎，取一定量的魚漿于2 000 ml燒杯中，在55℃水浴鍋恒溫酶解。于0、3、5、7、9、12、24 h分別取樣，迅速于-20℃冷凍保存。真空冷凍干燥后備用。

1.3 主要成分的測定

水分測定采用真空冷凍干燥方法；粗蛋白測定采用凱氏定氮方法（GB/T 5009.5—2010）；粗脂肪測定采用索氏抽提方法（GB/T14772—2008）；灰分測定按照（GB/T 5009.4—2010）標(biāo)準(zhǔn)測定。

1.4 營養(yǎng)指標(biāo)的測定

游離氨基氮測定采用茚三酮比色法；菌落總數(shù)測定采用GB/T 4789.2—2010方法；游離氨基酸測定采用SYKAM S—433D氨基酸分析儀；揮發(fā)性鹽基氮測定采用SC/T 3032—2007方法；生物胺測定采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；丙二醛測定采用TBA比色法；過氧化值測定采用比色法（GB/T 5009.37—2003）；酸價(jià)測定采用GB/T 5009.37—2003方法；脂肪酸測定采用GB/T 17277—2008方法。

2 結(jié)果

2.1 鳀魚主要成分

鳀魚主要營養(yǎng)成分見表1。由表1可知，鳀魚的水分含量為76.08%，干物質(zhì)為23.92%，含有豐富的蛋白質(zhì)，具有較高的開發(fā)價(jià)值。將其水解成多肽、游離氨基酸，將更有利于魚類的吸收，提高鳀魚的利用率。

表1 鳀魚主要成分（%）

2.2 鳀魚酶解效果的分析

2.2.1 鳀魚酶解過程中游離氨基氮含量的變化

以自溶組（C組）魚漿為樣本，測定酶解樣品中游離氨基氮含量，結(jié)果見圖1。從圖1可知，在55℃條件下，酶解液中氨基氮的含量隨時(shí)間不斷增加，酶解前9 h氨基氮增加較快，9 h后增加緩慢，確定酶解時(shí)間為9 h。

圖1 鳀魚酶解過程中游離氨基氮含量的變化（濕重）

2.2.2 鳀魚酶解過程中細(xì)菌總數(shù)的變化

為探討酶解過程中細(xì)菌的生長、防止細(xì)菌對蛋白質(zhì)類物質(zhì)的腐敗作用和油脂的氧化作用，試驗(yàn)A、E+A組添加抗生素，抗生素對鳀魚魚漿的抑菌效果見圖2。從圖2可知，C組、E組（無抗生素）魚漿中細(xì)菌總數(shù)隨時(shí)間的變化為∶7 h以前魚漿中細(xì)菌總數(shù)小于4×104CFU/g，而9 h細(xì)菌總數(shù)就超過了1×105CFU/g。添加了抗生素的A組、E+A組添加抗生素有效地抑制了微生物的繁殖，9 h細(xì)菌總數(shù)也沒有超過4×104CFU/g。因此，如果在實(shí)際生產(chǎn)中，為了避免魚漿中加入抗生素，在55℃自溶條件下，可以將酶解時(shí)間控制在7 h左右。

圖2 鳀魚酶解過程中細(xì)菌總數(shù)的變化

2.2.3 鳀魚酶解過程中蛋白質(zhì)水解、腐敗產(chǎn)物的變化

2.2.3.1 氨基酸的變化（見表2）

表2中顯示了鳀魚酶解過程中游離氨基酸含量（FAA）的變化。從表2中可以看出，酶解9 h，F(xiàn)AA含量顯著升高，C組達(dá)到了14.97 g/100 g，C、A、E和E+A四個(gè)處理分別增加158.9%、168.1%、139.3%、145.8%。E組FAA含量比C組高532.20 mg/g，但與氨基酸含量相比，這一差異非常微小。C組FAA含量與A、E+A組差異同樣較小，僅為A、E+A組的1.08～1.09倍，而微生物約為600倍，表明FAA的生成主要受鳀魚蛋白酶作用，微生物的作用較弱。

2.2.3.2 揮發(fā)性鹽基氮的變化

魚漿酶解過程中揮發(fā)性鹽基氮（VBN）含量的變化見表3。從表3可知，VBN在酶解前3 h升高最快，5 h后A組VBN生成量顯著高于C組(P＜0.05)，微生物對VBN生成影響顯著(P＜0.05)。酶解9 h后，C組鹽基氮水平與加抗生素組(A組)揮發(fā)性鹽基氮差異顯著(P＜0.05)。酶解完成后，VBN分別升高了127.38%～135.96%。

2.2.3.3 生物胺的變化

鳀魚酶解過程中生物胺含量的變化見表4。由表4可知，酶解完成后，對照組組胺含量與原料魚差異不大，4個(gè)試驗(yàn)組腐胺、精胺、亞精胺含量降低；試驗(yàn)組尸胺含量升高86.9、98.5、190.2、104.7 mg/kg，A組比其它組高出34.47%～44.85%。

表2 鳀魚魚漿游離氨基酸含量的變化（干重）（mg/100 g）

表3 鳀魚酶解過程中揮發(fā)性鹽基氮的變化(干重)(mg/100 g)

表4 鳀魚魚漿生物胺含量的變化(干重)(mg/kg)

2.2.4 鳀魚酶解過程中油脂氧化的變化

2.2.4.1 脂肪酸組成的變化

鳀魚極易腐爛，不飽和脂肪酸含量較高，因此在酶解期間常出現(xiàn)脂肪氧化現(xiàn)象。鳀魚酶解后脂肪酸含量的變化見表5。從表5中可知，鳀魚不飽和脂肪酸（UFA）占脂肪總量的42.29%，酶解后UFA含量降低8.1%～10.4%，飽和脂肪酸（SFA）含量升高4.4%～6.4%，UFA酶解過程中部分轉(zhuǎn)化為SFA。A、E+A組UFA含量高于C、E組，微生物對UFA的轉(zhuǎn)化有一定影響。

表5 鳀魚酶解過程中脂肪酸的變化（干重）（mg/100 g）

2.2.4.2 脂肪酸氧化指標(biāo)的變化

鳀魚酶解過程中丙二醛（MDA）、過氧化值（POV）、酸價(jià)（AV）的變化見表6。由表6可知，酶解過程中C組POV最高，A組最低，結(jié)束后A組比C組低41.71%、E組比C組低31.71%，差異顯著（P＜0.05），木瓜蛋白酶和抗生素都可降低POV，但抗生素效果更好。

表6 鳀魚酶解過程中MDA、POV、AV的變化（干重）

酶解過程中MDA含量也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，各試驗(yàn)組MDA峰值均在300 mg/kg左右（A組除外），C組峰值在5 h，E、E+A組在3 h，E+A組3 h后MDA含量迅速降低，而A組波動較小，酶解結(jié)束后MDA含量均低于初始階段。

各處理組的AV在前3 h迅速升高，3 h后升高速率降低，7 h后基本穩(wěn)定，酶解完成后AV在3.30～3.46 mg/g之間。酶解過程中A組AV低于其它試驗(yàn)組，與C組差異顯著，但A組酸價(jià)只比C組低0.16。E+A組AV高于A組，但E組與C組無顯著性差異，說明木瓜蛋白酶的作用被微生物抑制。

2.3 魚漿與商業(yè)魚粉的比較

以對照組魚漿與商業(yè)魚粉理化指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果見表7。由表7可知，試驗(yàn)魚漿與魚粉理化指標(biāo)差異較大，粗蛋白、粗脂肪、FAA、VBN含量分別比魚粉高出5.85%、84.29%、750.57%、1 154.20%，粗灰分、組胺、AV比魚粉低35.73%、19.35%、60%。

表7 魚漿與商業(yè)魚粉部分理化指標(biāo)實(shí)測值（干重）

3 討論

3.1 酶解魚漿的營養(yǎng)指標(biāo)

鳀魚蛋白質(zhì)在內(nèi)源蛋白酶作用下水解成多肽、游離氨基酸，均屬于氨基氮。55℃下酶解24 h游離氨基氮含量顯著升高，表明鳀魚魚漿酶解程度較高，后期游離氨基氮升高緩慢，水解反應(yīng)降低?？赡苁敲附獬跗邝桇~內(nèi)源蛋白酶活力較強(qiáng)，催化速率較快，隨著反應(yīng)進(jìn)行，蛋白酶活性降低，催化速率減慢；隨著酶解進(jìn)行，反應(yīng)底物減少，產(chǎn)物增加，抑制酶解反應(yīng)進(jìn)行。崔春在研究藍(lán)園鯵的自溶機(jī)制時(shí)提到，魚體自溶主要是鈣激活蛋白酶和胰蛋白酶發(fā)揮作用，高溫使蛋白酶迅速失活[10]。

外源木瓜蛋白酶、微生物對游離氨基酸含量影響較小，內(nèi)源蛋白酶是主要作用，這與李平蘭等[11]在發(fā)酵香腸的研究結(jié)果相似。VBN含量的變化與水產(chǎn)品的腐敗程度存在明顯的對應(yīng)關(guān)系，有研究表明，低溫貯存下細(xì)菌總數(shù)升高與VBN變化一致[12]。本研究中，VBN在酶解前3 h升高最快，此時(shí)微生物未進(jìn)入繁殖期，表明在55℃下酶解9 h，微生物不是VBN變化的主要原因。生物胺由脫羧酶生成、胺氧化酶降解[13]，保存期內(nèi)微生物種類變化大[14]，不同的微生物生成[15]、降解[16]生物胺能力不同。本試驗(yàn)表明，在55℃酶解過程中微生物對組胺、腐胺、精胺、亞精胺主要表現(xiàn)為降解作用，對尸胺表現(xiàn)為生成作用。

鳀魚不飽和脂肪酸含量較高，這與蔣定文的研究結(jié)果相似[17]，但部分脂肪酸組成與之差異較大，可能與我們采用真空冷凍干燥而文獻(xiàn)報(bào)道的是60℃干燥樣品有關(guān)。MDA、AV、POV是評價(jià)油脂氧化的重要指標(biāo)，抗生素能有效降低MDA、POV、AV，可能是降低了微生物的代謝活動產(chǎn)生的酸性物質(zhì)，酶解完成后MDA低于原料魚，POV、AV水平低，表明魚漿油脂氧化程度不高。

魚漿酶解不經(jīng)過脫脂處理，粗脂肪含量比商業(yè)魚粉高出84.29%，高于魚粉標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的11%（特級品）[18]。魚漿FAA含量比魚粉高1 154.2%，而FAA含量對魚類生長可能有重要作用。魚漿VBN含量為656.45 mg/kg，原因可能是酶解過程不經(jīng)高溫，VBN揮發(fā)量減少。魚漿與商業(yè)魚粉理化指標(biāo)差異較大，其對魚類生長的作用還有待進(jìn)一步研究。

3.2 酶解條件的分析

周明明[1]在對鳀魚酶解的研究中發(fā)現(xiàn)催化水解反應(yīng)的最適溫度為55℃左右，溫度較低時(shí)腐敗菌繁殖加快，會增加魚漿發(fā)生腐敗的危險(xiǎn)。本試驗(yàn)以抗生素防止細(xì)菌對蛋白質(zhì)的腐敗作用和油脂的氧化作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在實(shí)際生產(chǎn)中，在55℃自溶條件下，不必添加抗菌劑，微生物對鳀魚魚漿營養(yǎng)成分變化影響較小，如需控制微生物數(shù)量可以將酶解時(shí)間控制在7～9 h。在對外源蛋白酶的研究中發(fā)現(xiàn)，外源木瓜蛋白酶對鳀魚魚漿影響較小，可能是所添加外源酶活力遠(yuǎn)小于組織酶或木瓜蛋白酶在本試驗(yàn)條件下活性，因此在實(shí)際生產(chǎn)中不需要添加外源酶。

4 結(jié)論

鳀魚的蛋白質(zhì)含量為（17.71±0.36）%，在55℃條件下，鳀魚的最適酶解時(shí)間為7～9 h，酶解完成后游離氨基酸含量為14.97 g/100 g左右（干物質(zhì)）。揮發(fā)性鹽基氮和尸胺含量升高顯著；組胺、腐胺、精胺、亞精胺含量降低，酶解過程對其表現(xiàn)為降解作用。酶解鳀魚不飽和脂肪酸部分轉(zhuǎn)化為飽和脂肪酸，酸價(jià)、丙二醛、過氧化值與原料魚差別不大，油脂氧化程度較低。在55℃條件下鳀魚蛋白質(zhì)酶解迅速，蛋白質(zhì)腐敗和油脂氧化主要受組織酶作用，外源木瓜蛋白酶、微生物對其影響較小。