■左亞男 鄭 偉，2 劉凡寧 陳秀梅 王桂芹 叢林梅 田佳鑫 楊秋實(shí)

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林省延邊州水產(chǎn)技術(shù)推廣站，吉林延邊 133002；3.吉林省新立城水庫(kù)管理局，吉林長(zhǎng)春 130119)

因大豆蛋白質(zhì)含量高，且氨基酸配比與魚(yú)類(lèi)需求相接近，是替代魚(yú)粉的最佳植物蛋白源，但大豆及其制品的添加，其中的抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)魚(yú)類(lèi)的消化、代謝及其生產(chǎn)性能產(chǎn)生一定負(fù)面影響（王桂芹等，2006），以及氨基酸的不平衡性等導(dǎo)致不能全部替代（王桂芹等，2009）。膨化大豆是將整粒大豆加熱（130～145℃）膨化，可破壞細(xì)胞壁和抗?fàn)I養(yǎng)因子,使得淀粉糊化，從而提高魚(yú)類(lèi)對(duì)大豆蛋白的消化。在漁用顆粒飼料中使用膨化全脂大豆，可減少額外噴涂加油脂的加工費(fèi)用。但研究多局限在不同大豆制品等對(duì)魚(yú)粉的替代（王桂芹等，2010），而關(guān)于補(bǔ)充限制性蛋氨酸的膨化全脂大豆粉對(duì)魚(yú)粉的替代沒(méi)有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以烏鱧為研究對(duì)象，用膨化全脂大豆粉替代魚(yú)粉，同時(shí)補(bǔ)充限制性蛋氨酸，旨在為膨化全脂大豆粉的合理應(yīng)用、優(yōu)化烏鱧飼料配方、保護(hù)養(yǎng)殖環(huán)境提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)飼料以魚(yú)粉和膨化全脂大豆粉為蛋白源來(lái)配制半純合飼料。膨化全脂大豆粉和魚(yú)粉的營(yíng)養(yǎng)組成見(jiàn)表1。設(shè)計(jì)大豆蛋白分別替代0%、20%、40%、60%、80%、100%的魚(yú)粉蛋白，同時(shí)按照烏鱧營(yíng)養(yǎng)需求添加蛋氨酸配成6種等氮、等能的飼料，其中飼料蛋白質(zhì)和能量分別為41%和18.5 kJ/g（表2），飼料原料按要求粉碎，按配方稱(chēng)重、混均，擠壓成顆粒（直徑為1.5 mm），曬干后冷藏保存、備用。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)烏鱧幼魚(yú)為同一批健康的烏鱧一齡魚(yú)種。試驗(yàn)前暫養(yǎng)于室內(nèi)水族箱中，投喂試驗(yàn)飼料進(jìn)行馴化15 d。飼養(yǎng)試驗(yàn)為期8周。試驗(yàn)前，停食24 h，挑選健康、均勻的烏鱧魚(yú)種，稱(chēng)體重、量體長(zhǎng)，隨機(jī)放養(yǎng)，每種飼料設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚(yú)，日投喂率為魚(yú)體重2.5%～4.0%，視其攝食情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。每天9：00、17：00飽食投喂，收集殘餌。試驗(yàn)期間溶解氧＞5 mg/l，氨氮＜0.5 mg/l，pH值(7.1±0.1)，水溫24～28℃。

表1 膨化全脂大豆粉和魚(yú)粉的營(yíng)養(yǎng)組成及烏鱧營(yíng)養(yǎng)需求(%)

表2 試驗(yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平(干重)

1.3 樣品收集與測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束前停食24 h，每組按每個(gè)重復(fù)稱(chēng)重，用于計(jì)算生長(zhǎng)和飼料利用指標(biāo)，并分別取魚(yú)5尾，取背鰭下側(cè)線上白肌用于測(cè)定其常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分。常壓干燥法、半微量凱氏定氮法、索氏抽提法、干灰化法分別測(cè)定水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分。具體計(jì)算指標(biāo)如下：

式中：I——攝入飼料的重量(g)；

W0、Wt、Wd——分別為試驗(yàn)開(kāi)始和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)及死魚(yú)的總重量；

CP——飼料蛋白質(zhì)的含量（%）；

t——試驗(yàn)的天數(shù)（d）。

1.4 蛋白酶、代謝酶和氮排泄的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后停食1 d，隨機(jī)從每重復(fù)取魚(yú)10尾，麻醉(200 mg/l MS-222)后，尾靜脈取血，4℃靜置24 h，取血清。將采過(guò)血的烏鱧冰上解剖，取出腸道和肝臟，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

測(cè)定血清及肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)(南京建成)，腸道的取樣和蛋白酶的測(cè)定見(jiàn)錢(qián)曦等(2007)方法，氮排泄的測(cè)定見(jiàn)王桂芹等(2008)方法。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan's法多重比較，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 飼料中膨化全脂大豆添加蛋氨酸對(duì)烏鱧生長(zhǎng)和飼料利用的影響(見(jiàn)表3)

表3 飼料中膨化全脂大豆添加蛋氨酸對(duì)烏鱧生長(zhǎng)和飼料利用的影響

隨著飼料中膨化全脂大豆替代魚(yú)粉比例的增加，烏鱧的平均增重率發(fā)生變化，當(dāng)替代20%魚(yú)粉蛋白時(shí)，烏鱧的平均增重率顯著高于80%和100%替代組（P＜0.05），與對(duì)照組相比差異不顯著，當(dāng)替代量為100%時(shí)，烏鱧的增重率顯著低于對(duì)照組和其它各組。飼料中膨化全脂大豆添加蛋氨酸對(duì)烏鱧的攝食率沒(méi)有顯著影響。20%替代組的蛋白質(zhì)效率顯著高于對(duì)照組和其他各試驗(yàn)組（P＜0.05），100%替代組的蛋白質(zhì)效率顯著低于對(duì)照組和其他各試驗(yàn)組（P＜0.05），飼料系數(shù)與之有相反的趨勢(shì)。

2.2 飼料中膨化全脂大豆添加蛋氨酸對(duì)烏鱧蛋白消化、代謝酶及氮排泄的影響（見(jiàn)表4、表5)

表4 飼料中膨化全脂大豆添加蛋氨酸對(duì)烏鱧蛋白消化和代謝酶的影響

隨著飼料中膨化全脂大豆添加蛋氨酸替代比例的增加，烏鱧腸道蛋白酶活性呈下降趨勢(shì)，100%與80%替代組相比烏鱧腸道蛋白酶活性之間差異不顯著，但顯著低于對(duì)照組和20%替代組（P＜0.05）。隨著飼料中膨化全脂大豆添加蛋氨酸替代比例的增加，肝臟AST和ALT、血清AST和ALT逐漸升高，都是80%和100%替代組烏鱧肝臟AST和ALT、血清AST和ALT之間差異不顯著，但顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。隨著飼料中膨化全脂大豆添加蛋氨酸替代比例的增加，烏鱧氨氮的排泄量升高，60%、80%和100%替代組顯著高于對(duì)照組和其他各組（P＜0.05）。

表5 飼料中膨化全脂大豆添加蛋氨酸對(duì)烏鱧氮排泄的影響

2.3 飼料中膨化全脂大豆添加蛋氨酸對(duì)烏鱧肌肉組成的影響（見(jiàn)表6）

表6 飼料中膨化全脂大豆對(duì)烏鱧肌肉組成的影響(%)

隨著飼料中膨化全脂大豆添加蛋氨酸替代比例的增加，烏鱧肌肉水分含量逐漸上升，而蛋白質(zhì)、脂肪和灰分含量則有逐漸下降的趨勢(shì)，但各處理組間差異不顯著。

3 討論

3.1 飼料中膨化全脂大豆添加蛋氨酸替代魚(yú)粉的適宜量

相對(duì)草食性和雜食性魚(yú)類(lèi)而言，肉食性魚(yú)類(lèi)對(duì)大豆蛋白的利用最差，主要原因是大豆中存在魚(yú)類(lèi)敏感的抗?fàn)I養(yǎng)因子（如胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白、凝集素等）（Olli等，1994）和蛋氨酸缺乏導(dǎo)致的氨基酸不平衡（Webster等，1992）等影響其攝食、降低飼料利用，從而影響生長(zhǎng)和健康。

近年開(kāi)展不同加工形式的大豆制品對(duì)魚(yú)粉蛋白的替代，如王桂芹等（2010）研究不同處理方式的大豆制品對(duì)鯉的影響，發(fā)現(xiàn)對(duì)熱敏感和不敏感的大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子的負(fù)面影響。本試驗(yàn)針對(duì)肉食性魚(yú)類(lèi)利用大豆蛋白較差的原因和加工工藝等問(wèn)題，選擇淡水兇猛肉食性的烏鱧幼魚(yú)為研究對(duì)象，選擇全脂膨化大豆添加包膜蛋氨酸替代魚(yú)粉，最大限度地消除抗?fàn)I養(yǎng)因子、氨基酸不平衡和加工中減少脂肪額外添加的麻煩。本試驗(yàn)在烏鱧全脂膨化大豆蛋白飼料中添加蛋氨酸，使得大豆蛋白替代魚(yú)粉的含量達(dá)到60%～80%。遠(yuǎn)高于虹鱒（Krogdahl等，1994）和石斑魚(yú)（Luo等，2004）的替代量為20%和25%。造成大豆蛋白替代量提高但卻不能100%替代的主要原因：一是膨化加工的高溫高壓，可使對(duì)熱敏感的大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子（如抗胰蛋白酶和凝集素等）失活，使細(xì)胞內(nèi)的脂肪和蛋白質(zhì)等養(yǎng)分釋放更易被烏鱧消化吸收，從而提高養(yǎng)分消化吸收率和替代的比例。二是大豆中限制性蛋氨酸的添加保證了必需氨基酸在一定程度的平衡，提高蛋白質(zhì)的利用效率。如以去脂大豆添加限制性氨基酸的飼料飼喂鯉、鲇和牙鲆，可分別替代100%、70%和45%的魚(yú)粉蛋白（Murai等，1986；Webster等，1992；Kikuchi等，2003）。三是膨化加工不能使某些如抗原蛋白等抗?fàn)I養(yǎng)因子完全失活或鈍化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的消化率和氨基酸的利用率降低，影響烏鱧的生長(zhǎng)。如Rumsey等（1993）和王桂芹等(2010）報(bào)道的經(jīng)過(guò)加熱處理的豆粕飼喂虹鱒和鯉，同樣表明其生長(zhǎng)受限，對(duì)熱穩(wěn)定的免疫活性的大豆抗原仍然存在。所以本試驗(yàn)100%的膨化大豆蛋白替代影響烏鱧的飼料利用和魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)。

3.2 飼料中膨化全脂大豆添加蛋氨酸對(duì)烏鱧蛋白質(zhì)代謝的影響

腸道的蛋白酶的活性隨著大豆蛋白替代量的提高而降低，是因?yàn)橐鹊鞍酌敢种埔蜃雍托∧c中胰蛋白酶結(jié)合生成無(wú)活性的復(fù)合物，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的消化利用率降低（王桂芹等，2006）。吳莉芳等（2014）對(duì)鯉飼料添加大豆抗原蛋白，結(jié)果表明，添加量為30 g/kg時(shí)，鯉稚魚(yú)中腸和后腸皺襞高度下降，添加量為60 g/kg時(shí)，鯉幼魚(yú)后腸皺襞高度下降，兩者腸道形態(tài)均出現(xiàn)不同程度的破壞。黑鯛幼魚(yú)飼料中混合蛋白（肉骨粉∶大豆分離蛋白=1∶1）可替代45%魚(yú)粉（黎慧等，2014）。本試驗(yàn)膨化全脂大豆添加蛋氨酸100%替代組影響到烏鱧腸道消化酶的活性。

轉(zhuǎn)氨酶（谷丙和谷草轉(zhuǎn)氨酶）是氨基酸代謝的關(guān)鍵酶，可反映氨基酸代謝強(qiáng)度的大小，生物膜結(jié)構(gòu)遭到破壞時(shí)逸到胞外，有研究表明，血清中GPT含量可以反映金鯽肝、腎細(xì)胞受損程度（王虹揚(yáng)等，2006）。黑鯛幼魚(yú)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性隨混合蛋白(添加包膜必需蛋氨酸、賴氨酸和精氨酸)替代比例的增加而顯著增大(黎慧等，2014)。有報(bào)道大豆抗原蛋白影響鯉稚魚(yú)和幼魚(yú)血液轉(zhuǎn)氨酶活性（賴紅娥等，2013）。本試驗(yàn)膨化全脂大豆添加蛋氨酸80%替代組影響到烏鱧血液轉(zhuǎn)氨酶的活性，表明影響到肝臟的代謝，但沒(méi)有影響生長(zhǎng)。

氮排泄高低與飼料蛋白的質(zhì)量和數(shù)量有關(guān)。將（4.86±0.02）g虹鱒稚魚(yú)在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行為期90 d的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，添加氨基酸時(shí)，大豆蛋白替代水平增加到40%，氮排泄逐漸降低，替代水平由40%增加100%時(shí)，氮排泄逐漸升高（王裕玉等，2011）。而在中華絨螯蟹飼料中，大豆分離蛋白的替代比例超過(guò)56.89%時(shí)，氨氮排泄率顯著性升高（李二超等，2005)。本試驗(yàn)膨化全脂大豆添加蛋氨酸100%替代組提高氮排泄，表明過(guò)量添加影響到肝臟氨基酸的代謝。

本試驗(yàn)膨化處理大豆可消除對(duì)熱敏感的抗?fàn)I養(yǎng)因子的負(fù)面影響，添加蛋氨酸可一定程度保證必需氨基酸的平衡，但過(guò)量添加仍然影響生長(zhǎng)和代謝，表明對(duì)熱不敏感的大豆抗原蛋白的負(fù)面作用，大豆抗原蛋白被吸收后以完整的大分子蛋白質(zhì)吸收，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，引起腸黏膜損傷，蛋白質(zhì)表觀消化率下降（賴紅娥等，2013）。

4 小結(jié)

在本試驗(yàn)條件下，添加蛋氨酸的膨化全脂大豆蛋白對(duì)烏鱧飼料中魚(yú)粉蛋白的最大替代量為60%～80%。遠(yuǎn)高于其他肉食性魚(yú)類(lèi)，原因是膨化及添加限制性蛋氨酸促進(jìn)烏鱧對(duì)大豆的利用，但因?qū)岵幻舾械拇蠖箍乖鞍状嬖趯?dǎo)致仍然不能100%的替代，生產(chǎn)上膨化全脂大豆應(yīng)適當(dāng)與其它蛋白源搭配使用，降低飼料成本和油脂額外添加的成本和消耗。