丁雅迪，王金華，2，繆?？。虏?，謝恩來，熊智

(1．西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明650224;2．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明650201;3．云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明650201)

蘆薈 (Aloe chinensis)是百合科多年生草本植物，主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)。蘆薈因富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、活性酶、維生素等活性物質(zhì)及有益微量元素而廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、美容、保健、食品等領(lǐng)域［1～2］。由于巨大的商業(yè)價(jià)值引起了許多國家的高度重視，并在世界各地廣泛栽培［3］。近年來，我們國家對(duì)蘆薈的開發(fā)應(yīng)用研究從20世紀(jì)末開始起步，主要集中在化妝品［4］、藥用［5～7］、保健飲料［8～9］、酒制品［10～11］、奶制品［12］等方面以及作為植物殺菌劑［13］防治植物病害，廣泛的需求催生了蘆薈的產(chǎn)業(yè)化種植，這種產(chǎn)業(yè)化種植尤以云南、海南、四川、福建等地范圍廣［14］。然而，在大規(guī)模的種植過程中，根腐病嚴(yán)重地制約了蘆薈產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。僅在2004年云南省的根腐病發(fā)病率達(dá)到42．54%、死亡率高達(dá) 26．36%［15］，研究蘆薈根腐病及其防治已成為目前的研究熱點(diǎn)。有關(guān)蘆薈根腐病方面的研究還鮮有報(bào)道。故本研究對(duì)蘆薈根腐病病原菌進(jìn)行分離純化研究，結(jié)合形態(tài)與ITS測序方法鑒定其病原菌，并采用回接方法對(duì)其致病性進(jìn)行測定分析，為蘆薈根腐病的生物防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

采自云南省林業(yè)科學(xué)院、西南林業(yè)大學(xué)具典型根腐病癥狀的蘆薈及健康蘆薈各10株作為分離樣品，采集后置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫⒂^察記載田間癥狀表現(xiàn)。

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)，配方見參考文獻(xiàn)［16］。Ezup柱式基因組 DNA抽提試劑盒 (真菌)、2×Taq PCR Master Mix等均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.2 方法

1．2．1 病原菌的分離和純化

取蘆薈根腐病樣品根段，在病健組織處取樣［17］，樣品表面經(jīng)流動(dòng)自來水沖洗干凈后，用75%乙醇處理30 s，無菌水2～3次，用0．1%升汞溶液消毒2 min，無菌水刷洗4～5次，再用滅菌濾紙將根上的水吸干，用無菌解剖刀將根切成5 mm長的根段，接種于PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿放4個(gè)根段，28℃下恒溫培養(yǎng)，初步鑒定分離純化后轉(zhuǎn)管，保存于4℃冰箱中備用。健康蘆薈樣品根段按照上述方法分離純化并與患病樣品根段分離出的真菌進(jìn)行對(duì)比。

1．2．2 病原菌致病性測定

采用離體根部接種法［17］進(jìn)行病原菌的致病性測定，即選取蘆薈1年生健康幼根作為接菌材料，將上述幼根截為6 cm長的根段，將經(jīng)過分離純化得到的蘆薈病原菌打成菌餅，分別做刺傷和無刺傷接菌，幼根段采用刺傷接菌法均勻接3個(gè)菌餅，每個(gè)PDA平板中接兩個(gè)根。3次重復(fù)，共18個(gè)接種點(diǎn)。無刺傷接菌法采用同種方法處理。將刺傷和無刺傷不接菌幼根段分別接種于PDA平板中作為對(duì)照。對(duì)上述所有處理根段兩端用脫脂棉包裹，置于25℃培養(yǎng)箱中無菌水保濕48 h后觀察發(fā)病情況，第10天統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。并從發(fā)病部位再次分離病原菌，與初次所接病原菌的異同。

1．2．3 病原菌的形態(tài)觀察

參照真菌分類鑒定方法，將致病性接種確定的病原菌在PDA培養(yǎng)基中活化后，挑取適量菌體制成切片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。同時(shí)結(jié)合菌株菌落形態(tài)特征，包括性狀、顏色、質(zhì)地、分生孢子大小、邊緣特征、生長率等情況，初步確定病原菌的種屬地位。

1．2．4 菌株DNA提取及ITS PCR擴(kuò)增

采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒 (真菌)提取根腐病病原菌基因組DNA，經(jīng)1．2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，將其作為ITS序列DNA擴(kuò)增的模板。ITS序列PCR擴(kuò)增采用通用引物ITS1和ITS4〔生工生物工程 (上海)股份有限公司提供〕［18］。PCR 反應(yīng)體系為模板 DNA 1 μL、2 × Taq Master Mix 12．5 μL、正、反引物 (10 μmol/L)各1 μL，補(bǔ)充去離子水至 25 μL。PCR 擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s;56℃退火45 s;72℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸 10 min。取5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測經(jīng)4S Green Nucle Acid染色，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測并拍照。

1．2．5 ITS序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司純化并測序。序列提交至GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫并得到登錄號(hào)，應(yīng)用Blast程序?qū)λ鶞y得菌株ITS-rDNA序列進(jìn)行相似性檢索。采用MEGA 5．1軟件進(jìn)行多序列的比對(duì)，比對(duì)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根腐病癥狀描述

蘆薈根腐病主要危害根部和莖基部。初呈水漬狀病變，后褐色腐爛。主根腐爛或壞死，容易拔出，由下往上發(fā)展，地上部由基部葉的邊緣開始變?yōu)榧t褐色，逐漸發(fā)展為全株葉片呈失水狀柔軟下垂，葉片和莖干枯。嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致植株萎蔫死亡(圖1)。

圖1 蘆薈根腐病癥狀Fig．1 The symptoms of aloe root rot

2.2 病原菌的分離及致病性測定

從蘆薈病株根部分離得到1個(gè)菌株，而從健康蘆薈根段并未分離出此菌株，說明這個(gè)菌株是蘆薈病株特有菌株，命名為YNLH06。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察這個(gè)菌株初步鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。將這株菌(YNLH06)進(jìn)行致病性測定(表1)，對(duì)照組刺傷、無刺傷不接菌餅的根段均無病斑。刺傷、無刺傷接種YNLH06菌餅的根段均有病斑，病斑率分別為94．4%和66．7%，顯示的根腐病癥狀與初次分離病根發(fā)病情況相似，并從接種后發(fā)病部位分離的病原菌與接種所用病原菌為同種病菌，符合科赫法則，說明菌株YNLH06為蘆薈根腐病病原菌。

表1 菌株YNLH06致病性測定Tab．1 Determination of pathogenic strains YNLH06

2.3 菌落形態(tài)特征

在PDA培養(yǎng)基上，菌落凸起，菌落初為白色、粉紅色，6天后菌落中間逐漸變成紫紅色，絨狀角變，正反面顏色差異較大，反面分泌紫色色素。菌落高3～5 mm，小型分生孢子較多，單胞或雙胞，卵圓形、腎臟形，大小5～12 um×2～3．5 um;大型分生孢子較少，多胞，多有3個(gè)分隔，鐮刀形，大小19．6 ～39．4 um ×3．5 ～5．0 um;厚垣孢子球形 (圖 2)。參照真菌分類學(xué)［19］鑒定方法和Booth［20］鐮刀菌屬的分類系統(tǒng)初步鑒定菌株 YNLH06為尖孢鐮刀菌。

圖2 病原菌菌落特征和菌絲體光學(xué)顯微特征Fi g．2 Col ony and mycel i al mi cr oscopi c char act er ist ics of t he pat hogen

圖3 菌株YNLH06的rDNA ITS區(qū)段PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig ．3 Electrophoresis of PCR product of the rDNA ITS section amplified from YNLH06 strain

2.4 菌株ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增及序列測定

以引物ITS1和ITS4對(duì)YNLH06菌株的rDNA ITS區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物約545 bp(圖3)。此序列已在GenBank中注冊(cè)，登錄號(hào)為KP267760。

2.5 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的分析

序列提交至GenBank進(jìn)行Blast同源比對(duì)，選取同源性較高的部分菌株序列通過MEGA5．1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該菌株的種屬地位 (圖4)。白粉寄生孢菌 (Ampelomyces quisqualis)(HQ108042)為外類群，從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出菌株YNLH06與尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)(KM005088、KM005080、KC196121、JN859433、JN232195)在同一系統(tǒng)發(fā)育分支，相似度為100%。該菌株與輪狀鐮刀霉菌 (Fusarium verticillioides)(KM396284)、大刀鐮刀菌(Fusarium culmorum)(DQ453700、DQ450880)、馬鈴薯枯萎病菌(Fusarium avenaceum)(KM189441)和腐皮鐮孢霉菌(Fusarium solani)(HQ905461)同源性分別為92．2%，90．9%，90．1%，86．9%，85．2%。進(jìn)一步判定菌株YNLH06為尖孢鐮刀菌。

圖4 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹 (鄰接法)Fig．4 Phylogenetic tree(Neighbor-joining Tree)inferred from the fungal rDNA ITS sequences

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

從蘆薈新鮮病株根中分離純化出1個(gè)菌株YNLH06，致病性測定其為蘆薈根腐病病原菌，形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明其與尖孢鐮刀菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征相同;ITS序列分析表明，該菌株與尖孢鐮刀菌在同一系統(tǒng)發(fā)育分支，相似性為100%。因此認(rèn)定尖孢鐮刀菌為蘆薈根腐病病原菌。

3.2 討論

在致病性測定中，常采用灌根接種法［17］、蘸根接種法［17］、根部切傷接種法［21］。但相較于上述幾種方法，離體根部接種法具有周期性短，便于觀察，成本低，不需培育幼苗就可觀察到病原菌的致病性等優(yōu)勢。離體根部接種法中，刺傷接菌的發(fā)病率比無刺傷接菌的發(fā)病率高27．7%。說明病原真菌更容易通過傷口侵入植物。因此我們可以通過改良蘆薈培育方法對(duì)蘆薈根腐病進(jìn)行防治。

近年來研究發(fā)現(xiàn)根腐病普遍存在于大豆［22］、豌豆［23］、芹菜［24］、黃芪［25］等作物中，并迅速蔓延，有逐年惡化的趨勢，對(duì)作物的生產(chǎn)造成致命的危害。通常根腐病由多種病原菌復(fù)合侵染引起［26］，已鑒定出的種類主要有，層出鐮孢菌 (Fusarium proliferatum)、茄鐮刀菌 (F．solani)、尖孢鐮刀菌(F．oxysporum)、立枯絲核菌 (Rhizoctonia solani)、終極腐霉 (Pythium ultinum)、串珠鐮孢霉 (F．moniliforme)等［27～29］。蘆薈的根腐病病原菌侵染是否與其它植物根腐病病原菌的侵染情況一致，由多種病原菌復(fù)合侵染引起，及這種復(fù)合侵染對(duì)蘆薈根腐病的影響效應(yīng)。這些都有可能受到采樣時(shí)間、地點(diǎn)、生態(tài)環(huán)境并與升汞滅菌時(shí)間、所用培養(yǎng)基配方等條件的限制，仍然有待于進(jìn)一步反復(fù)摸索和不斷探究找出合理科學(xué)的研究方法。

［1］謝云飛，郇楠，曹元元，等．蘆薈中蘆薈苷的結(jié)構(gòu)表征及光譜分析［J］．光譜學(xué)與光譜分析，2014，34(2):386-388．

［2］肖玫，曹玉華，劉彪．蘆薈汁天然飲料工藝的研究［J］．食品科學(xué)，2005，26(1):271-274．

［3］萬金志，徐新軍，鐘佳勝，等．國外蘆薈藥品開發(fā)現(xiàn)狀與趨勢［J］．今日藥學(xué)，2013，23(1):59-62．

［4］任海毅，董銀卯，孟宏，等．蘆薈保濕活性成分篩選及皮膚適應(yīng)性研究［J］．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(3):252-256．

［5］張俊莉，蔡淑敏，李濤，等．蘆薈減阻劑對(duì)燒傷休克大鼠微循環(huán)的影響［J］．實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2014(10):1537-1540．

［6］李天東．羅英，韓文君．蘆薈的藥理作用及其應(yīng)用研究進(jìn)展［J］．2007，17(23):2881-2886．

［7］漆平強(qiáng)，楊莉，鄭慧凝，等．蘆薈汁對(duì)小鼠腹部傷口愈合情況影響的研究［J］．中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2014(15):28-30．

［8］韓宏偉．蘆薈保健飲料生產(chǎn)技術(shù)方案［J］．科學(xué)創(chuàng)新與應(yīng)用，2014(14):288．

［9］黃友琴，潘嫣麗，黃衛(wèi)萍，等．蘆薈葉肉懸浮飲料的研制［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(20):10884-10886．

［10］王麗娟，李再貴．蘆薈白酒功能性成分及體外抗氧化性研究［J］．中國釀造，2014，33(3):57-61．

［11］李艷紅．蘆薈啤酒加工工藝研究［J］．合作經(jīng)濟(jì)與科技，2014(14):180-181．

［12］李竹君，劉曉娟，張摯旋，等．蘆薈紅棗奶的制作工藝研究［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(25):13822-14024．

［13］袁仲玉，周會(huì)玲，田蓉，等．蘆薈粗提物對(duì)蘋果菜后灰霉病的防治效果與機(jī)理［J］．農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2014，30(4):255-263．

［14］何忠俊，周瓊，張忠萍，等．庫拉索蘆薈根腐病與土壤一植株養(yǎng)分狀況的關(guān)系研究［J］．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，24(2):255-291．

［15］姬廣海，吳亞鵬，張乃明，等．蘆薈根腐病病原菌的鑒定［J］．植物病理學(xué)報(bào)，2007，37(2):207-209．

［16］楊輝輝，王坦，黃思良，等．一株芝麻枯萎病菌的鑒定及其生物學(xué)特性［J］．中國油料作物學(xué)報(bào)，2014，36(3):385-392．

［17］方中達(dá)．植病研究方法［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998．

［18］桓明輝，李楊，劉曉輝，等．1株產(chǎn)纖維素酶木霉菌種的鑒定［J］．微生物學(xué)雜志，2012，32(5):65-68．

［19］邵力平．真菌分類學(xué)［M］．北京:中國林業(yè)出版社，1984．

［20］Booth C．The genus Fusarium［M］．Oxon:Commonwealth agricultural Bureaux，1971．

［21］曹雪梅，李生兵，張惠玲，等．甘草根腐病病原菌鑒定［J］．植物病理學(xué)報(bào)，2014，44(2):213-216．

［22］白劍宇，百麗燕，王登元，等．大豆根腐病病原菌PCR-RFLP鑒定體系的建立［J］．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(2):151-154．

［23］陳慶河，翁啟勇，何玉仙，等．福建省豌豆根腐病病原及致病性研究［J］．福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，19(1):28-31．

［24］石延霞，孟姍姍，陳璐，等．芹菜根腐類病害的病原菌鑒定及新型防治技術(shù)［J］．中國蔬菜，2014(6):71-73．

［25］陳垣，朱蕾，郭鳳霞，等．甘肅渭源蒙古黃芪根腐病病原菌的分離與鑒定［J］．植物病理學(xué)報(bào)，2011，41(4):428-431．

［26］劉亞亞，陳垣，郭鳳霞，等．掌葉大黃根腐病病原菌的分離與鑒定［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，30(1):199-225．

［27］王明道，時(shí)延光，郜峰，等．1株引起地黃根腐的鐮刀菌的鑒定及生物學(xué)特性研究［J］．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，47(2):177-181．

［28］張萍．葫蘆巴根腐病病原菌的鑒定［J］．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17(6):202-204．

［29］王多成，孟有儒，李文明，等．苜蓿根腐病病原菌的分離及鑒定［J］．草業(yè)科學(xué)，2005，22(10):78-81．