劉雯清，張璐璐，劉毅清，顧文文，顏天華，姜遠英，曹永兵，＊（.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 5008；.第二軍醫(yī)大學藥學院，上海 00；.第二軍醫(yī)大學訓練部，上海 00；.中國藥科大學藥學院，南京 0009）

·藥理·

天然產物增強阿霉素抗乳腺癌作用的體外篩選

劉雯清1，張璐璐2，劉毅清3，顧文文4，顏天華4，姜遠英2，曹永兵1，2＊（1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350108；2.第二軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433；3.第二軍醫(yī)大學訓練部，上海 200433；4.中國藥科大學藥學院，南京 210009）

目的 從植物天然產物中篩選具有增強阿霉素抗乳腺癌細胞增殖作用的活性化合物，并對兩藥聯(lián)合后的體外抗腫瘤活性進行初步評價。方法 采用MTT法研究15種單體化合物對人乳腺癌細胞MDA－MB－231的影響。結果 小檗堿、松蘿酸、魚腥草素鈉、槲皮素在50μg·mL－1時對MDA－MB－231細胞的抑制率分別為72%（P＜0.001），74%（P＜0.001），91%（P＜0.001）和59%（P＜0.01），且具有劑量依賴性。聯(lián)合用藥結果顯示，小檗堿與阿霉素聯(lián)用，CI值小于1。結論 小檗堿、松蘿酸、魚腥草素鈉、槲皮素對MDA－MB－231細胞的增殖活性具有抑制作用，同時，小檗堿與阿霉素聯(lián)用具有協(xié)同抗腫瘤作用。

天然產物；阿霉素；抗乳腺癌；聯(lián)合用藥；藥物篩選；MDA－MB－231；小檗堿

現(xiàn)有抗腫瘤藥物由于其具有較強的毒性和耐藥性，使其應用受到極大限制。近年來，越來越多的天然產物被證實具有抗腫瘤活性，能夠通過影響p53、PI3K／Akt／mTOR等腫瘤相關信號通路抑制腫瘤細胞增殖，與化療藥物聯(lián)用能夠發(fā)揮增效減毒的功效［12］。因此，探究耐藥機制及尋找新型分子靶向抗腫瘤藥物的同時，發(fā)現(xiàn)新的兩藥或多藥聯(lián)合針對多靶點的協(xié)同治療手段受到廣泛關注。本文對15種植物單體進行抗腫瘤活性的體外篩選，發(fā)現(xiàn)小檗堿、松蘿酸、魚腥草素鈉、槲皮素4種天然產物對乳腺癌細胞MDA－MB－231具有不同程度的抑制作用，其中小檗堿與阿霉素聯(lián)用顯示協(xié)同抗腫瘤作用，為后續(xù)治療乳腺癌聯(lián)合用藥的研究奠定了基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 CO2培養(yǎng)箱（Forma Scientific公司）；超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）；CKX41倒置顯微鏡（Olympus公司）；微量加樣器（Eppendorf公司）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；MTS酶標板振蕩器（IKA公司）；TDL80－2B飛鴿牌離心機（上海安亭科學儀器廠）；XW－80A渦旋混合器（上海醫(yī)科大學儀器廠）；INFINITE 200酶標儀（瑞士Tecan公司）。

1.2 試藥 鹽酸多柔比星（doxorubicin）、二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍（MTT），Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（trypsin－EDTA（1X）2.5g·L－1trypsin）、青霉素－鏈霉素（penicillin－streptomycin），Invitrogen公司；胎牛血清（FBS），Hyclone公司；cell counting Kit－8（CCK－8），碧云天生物技術研究所；PBS、MTT工作液（5mg·mL－1），自制。阿魏酸、綠原酸、苦豆堿、柚皮苷、橙皮苷、木犀草素、氧化苦參堿、絞股藍皂苷、小檗堿、芹菜素、蘆丁、槲皮素、魚腥草素鈉、水飛薊素和松蘿酸，均由上海融禾制藥科技有限公司提供（質量分數(shù)均大于98%）。

1.3 細胞 MDA－MB－231細胞（中科院上海藥物所丁健院士贈送）。

2 實驗方法

2.1 MDA－MB－231細胞生長曲線的測定 消化收集對數(shù)生長期細胞，計數(shù)調整細胞濃度，接種3×104個細胞／孔于12孔酶標板中，調零孔中只加培養(yǎng)基，每組3個復孔，并以MTT比色法連續(xù)測定7d（24，48，72，96，120，144和168h），考察細胞生長增殖狀態(tài)，并繪制生長曲線。MTT測定方法：輕輕吸除舊培液并加入新鮮培養(yǎng)基1mL／孔，加入MTT工作液100μL／孔，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4h后取出培養(yǎng)板，輕輕吸除培養(yǎng)基，加入1.5mL／孔DMSO，于平板振蕩儀上以300r·min－1震蕩10min，酶標儀測定吸光度值（參比波長630nm，測定波長570nm）［3－6］。

2.2 MTT法檢測藥物對MDA－MB－231抑制作用時細胞接種密度的摸索 常規(guī)消化收集對數(shù)生長期細胞，計數(shù)調整細胞濃度，分別接種1×103，2×103，4 ×103，8×103個細胞／孔于96孔酶標板中，每孔培養(yǎng)液體積200μL，調零孔中只加培養(yǎng)基，每組3個復孔。分別培養(yǎng)48h后，MTT法考察細胞相對數(shù)量。MTT測定方法：加入5mg·mL－1MTT工作液20 μL／孔，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4h后取出培養(yǎng)板，輕輕吸除培養(yǎng)基后加入150μL／孔DMSO，于平板振蕩儀上以600r·min－1震蕩10min，酶標儀測定吸光度值（參比波長630nm，測定波長570nm），并以吸光度值的大小比較細胞相對數(shù)量，A值一般在0.8～1.5較為合適［7］。

2.3 WST－8法檢測化合物對MDA－MB－231細胞增殖的影響 將實驗所需處于對數(shù)生長期的MDAMB－231細胞按4 000個細胞／孔的密度接種于96孔酶標板內，每孔內體積為100μL。置于孵箱內培養(yǎng)24h后，加入含終質量濃度為50mg·mL－1化合物的培液（每孔體積為100μL）作用，設置調零組與對照組。繼續(xù)置于孵箱內培養(yǎng)一段時間（48h）后，輕輕吸除含藥培液，加入100μL／孔新鮮培液，每孔加入10μL CCK－8溶液。繼續(xù)孵育3h后放于酶標儀上檢測（檢測波長為450nm，參比波長為650nm）。將檢測后的吸光度值整理后按下式計算化合物對細胞的生長抑制率。

2.4 MTT法檢測天然產物與阿霉素固定比例聯(lián)用對MDA－MB－231細胞增殖的影響 將實驗所需處于對數(shù)生長期的MDA－MB－231細胞按4 000個細胞／孔的密度接種于96孔酶標板內，每孔內體積為100μL?；衔锱cDOX按固定比例預混合，2倍比梯度稀釋，設8個質量濃度，每個質量濃度3復孔，并設置調零組與空白對照組。細胞貼壁24h后，加入含藥培養(yǎng)基100μL／孔，96孔板外圈填充PBS。藥物作用48h后，輕輕吸盡含藥培養(yǎng)基，加入新鮮培液100μL／孔，再加入10μL／孔MTT工作液（5 mg·mL－1），37℃孵育4h。取出96孔酶標板，吸盡培養(yǎng)基，加入150μL／孔DMSO，于平板振蕩器上震蕩10min，充分溶解甲瓚，以630nm為參比波長，570nm處測定A值。計算細胞增殖抑制率，并用SPSS 17.0Logit回歸考查量效曲線擬合度，計算IC50值及兩藥聯(lián)合指數(shù)CI。A、B兩藥聯(lián)合指數(shù)CI的計算及評價方法：CI＝A聯(lián)用IC50／A單用IC50＋B聯(lián)用IC50／B單用IC50，CI＜1協(xié)同，CI＝1相加，CI＞1無關或拮抗［8－11］。

2.5 數(shù)據(jù)處理 實驗結果數(shù)據(jù)用x±s表示，2組獨立樣本均數(shù)之間的比較用單因素方差分析進行統(tǒng)計，檢驗結果P＜0.05則被認為均數(shù)間差異具有統(tǒng)計學意義。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進行處理。

3 實驗結果

3.1 MDA－MB－231細胞生長曲線 隨著培養(yǎng)時間的延長，MTT檢測到MDA－MB－231細胞的A值逐漸升高。MDA－MB－231細胞在第1～4d處于對數(shù)生長期，第6～7d處于生長平臺期。見圖1。由MTT結果可知，MDA－MB－231細胞的藥物敏感性實驗宜在2～4d內進行（對數(shù)生長期）。

圖1 MDA－MB－231細胞生長曲線Fig.1 Cell growth curve of MDA－MB－231

3.2 MDA－MB－231細胞接種的摸索 結果見表1。隨著MDA－MB－231細胞接種密度的升高、培養(yǎng)時間的延長，吸光度值A會隨之增大。接種細胞數(shù)為4× 103～8×103個／孔培養(yǎng)48h后，或2×103～4×103個／孔培養(yǎng)72h后，或1×103個／孔培養(yǎng)96h后，較適用于細胞毒性實驗檢測腫瘤細胞藥物敏感性。

表1 MDA－MB－231細胞接種濃度與吸光度A值及培養(yǎng)時間的關系Tab.1 Relationship between the MDA－MB－231cell concentration，Aand incubating time ±s）

表1 MDA－MB－231細胞接種濃度與吸光度A值及培養(yǎng)時間的關系Tab.1 Relationship between the MDA－MB－231cell concentration，Aand incubating time ±s）

培養(yǎng)時間／h每孔接種不同細胞數(shù)A值8×103 4×103 2×103 1×10348 1.15±0.01 0.67±0.01 0.37±0.01 0.18±0.00 72 2.22±0.20 1.13±0.12 0.83±0.02 0.51±0.03 96 2.75±0.09 2.84±0.09 2.30±0.03 1.37±0.03

3.3 WST－8比色法檢測化合物對MDA－MB－231細胞增殖的影響 本實驗考察天然產物質量濃度為50 μg·mL－1時對MDA－MB－231細胞增殖的抑制率。結果見表2。15種天然產物中，小檗堿、松蘿酸、魚腥草素鈉、槲皮素對MDA－MB－231細胞有不同程度的殺傷作用（抑制率＞55%）。細胞增殖抑制率分別為72%（P＜0.001），74%（P＜0.001），91%（P＜0.001）和59%（P＜0.01）。

表2 15種化合物對MDA－MB－231細胞的抗增殖作用活性Tab.2 Cytotoxicity effect of 15natural products on MDA－MB－231cell proliferation ±s）

表2 15種化合物對MDA－MB－231細胞的抗增殖作用活性Tab.2 Cytotoxicity effect of 15natural products on MDA－MB－231cell proliferation ±s）

編號 天然產物（50μg·mL－1） 抑制率／%1小檗堿0.72±0.01 2阿魏酸 0.00±0.08 3綠原酸 －0.02±0.09 4苦豆堿 －0.01±0.02 5松蘿酸 0.74±0.02 6魚腥草素鈉 0.91±0.03 7槲皮素 0.59±0.12 8蘆丁 －0.02±0.13 9芹菜素 0.50±0.02 10 氧化苦參堿 0.07±0.09 11 柚皮苷 －0.14±0.15 12 水飛薊素 0.32±0.08 13 橙皮苷 －0.14±0.07 14 木犀草素 0.55±0.03 15 絞股藍皂苷0.03±0.03

3.4 候選化合物對MDA－MB－231細胞毒性作用的量效關系 對篩出的4種化合物（小檗堿、松蘿酸、魚腥草素鈉、槲皮素）進行量效關系的實驗考察，MTT結果顯示，4種候選化合物在50，25，12.5，6.25，3.125和1.562 5μg·mL－1的質量濃度下，隨著化合物劑量增加，A逐漸降低，MDA－MB－231活細胞數(shù)量逐漸減少，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，尤其是小檗堿和松蘿酸的劑量依賴性較好，在質量濃度降低后仍有較強的腫瘤細胞抑制作用。見圖2。

3.5 天然產物與阿霉素聯(lián)用對MDA－MB－231細胞增殖的影響 選取2.4實驗中抑制率劑量依賴性最好的小檗堿和松蘿酸進行聯(lián)合用藥實驗，考察其對MDA－MB－231細胞增殖的影響。結果見表3。結果顯示，小檗堿在特定聯(lián)合用藥劑量比例下與阿霉素聯(lián)用，較單獨用藥時，能夠顯著降低阿霉素的IC50值，而松蘿酸卻無此作用。分別計算這2種天然產物與阿霉素的聯(lián)合用藥指數(shù)CI值，評價兩藥相互作用模式，得出小檗堿在預設的3種劑量比例下與阿霉素聯(lián)用均能對阿霉素抗乳腺癌細胞MDA－MB－231發(fā)揮協(xié)同增效作用。

圖2 4種候選化合物對MDA－MB－231細胞毒性作用的量效關系A.小檗堿；B.松蘿酸；C.魚腥草素鈉；D.槲皮素Fig.2 Effect of 4natural products on cell viability inhibition of human breast cancer cell line MDA－MB－231A.berberine；B.usnic acid；C.sodium houttuyfonate；D.quercetin

表3 候選化合物聯(lián)合阿霉素對MDA－MB－231細胞的抗增殖作用Tab.3 Effect of 2compounds combined with DOX on MDAMB－231cell viability inhibition treated for 48h

4 討論

蒽環(huán)類抗生素是乳腺癌早期化療中的主要用藥，其中阿霉素是乳腺癌臨床化療聯(lián)合用藥最常用的代表藥物，廣泛用于治療實體瘤和血液腫瘤［12］。

然而，由于阿霉素易導致各類嚴重的器官毒性和全身毒性問題，尤其是劑量依賴的阿霉素性心肌病及各類胃腸道不良反應等，使其臨床應用受到極大限制［13］。近年來研究表明，化療藥物與天然藥物聯(lián)合應用往往能起到增效減毒的抗腫瘤活性［14－15］，因此，我們希望從天然產物中尋找聯(lián)合阿霉素具有增強抗腫瘤效應的化合物，通過降低阿霉素劑量，或者緩解其對正常器官的毒性，從而達到更有效治療乳腺癌的目的。

本文選取15種天然產物單體成分，用CCK8法及MTT法檢測藥物對細胞增殖的影響，初步考察了其抗乳腺癌活性及其劑量－效應關系，并且聯(lián)合阿霉素后評價其增效作用。我們首先對篩選工具細胞的增殖情況及藥物敏感性實驗方法學進行了初步考察，后對所選化合物進行一定劑量下的細胞毒性測定，發(fā)現(xiàn)4種天然產物單用時對乳腺癌MDA－MB－231細胞具有一定程度的抑制作用，且小檗堿和松蘿酸在低劑量下也具有抗腫瘤活性。隨后將小檗堿和松蘿酸分別與阿霉素在一定比例下聯(lián)合用藥，考察其協(xié)同增效作用。小檗堿在預設的聯(lián)合用藥劑量比例下與阿霉素聯(lián)用具有協(xié)同抗乳腺癌的作用，因此，我們考慮選取最佳候選化合物小檗堿用于后續(xù)研究，深入探索其聯(lián)合阿霉素在抗乳腺癌中的應用。

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Screening of natural products enhancing doxorubicin′s anti－breast cancer effect in vitro

LIU Wenqing1，ZHANG Lulu2，LIU Yiqing3，GU Wenwen4，YAN Tianhua4，JIANG Yuanying2，CAO Yongbing1，2＊（1.School of Pharmacy，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350108，China；2.School of Pharmacy，the Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；3.Training Department，the Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；4.School of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

Objective To screen the active anti－tumor compounds from natural herb products and make a preliminary assessment on the anti－tumor activities of their combination with doxorubicin in vitro.Methods MTT method was used to test 15monomeric compounds′anti－tumor effects on breast cancer cells MDA－MB－231 in vitro.Results The inhibition rates of berberine，usnic acid，sodium houttuyfonate and quercetin on MDA－MB－231cells were 72%（P＜0.001），74%（P＜0.001），91%（P＜0.001）and 59%（P＜0.01）at 50μg·mL－1in a dose－dependent manner.Drug combination results showed that CI values of berberine combined with doxorubicin was less than 1.Conclusion Berberine，usnic acid，sodium houttuyfonate and quercetin inhibited the proliferation of MDA－MB－231cells.Drug combination results showed that berberine combined with doxorubicin had synergistic antibreast cancer efficacy.

natural products；doxorubicin；anti－breast cancer；drug combination；drug screen；MDA－MB－231；berberine

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.015

R965

A

1004－2407（2015）02－0152－04

2014－11－07）

上海市自然科學基金面上項目（編號：

12ZR1437700）

劉雯清，女，在讀碩士研究生

＊通信作者：曹永兵，男，教授，博士生導師