吳 茜，查日維，謝曉梅，吳蓓麗，況作品，楊 沫

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，合肥230031)

中藥木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai干燥近成熟果實;有平肝舒筋、和胃化濕之功效［1］，以安徽宣城產(chǎn)宣木瓜質(zhì)量為佳［2-3］，三萜類、多酚以及多糖等［4-7］是木瓜活性成分的研究熱點。已有文獻［8］報道大孔樹脂分離木瓜三萜類成分，但鮮見木瓜在大孔樹脂不同洗脫部位活性成分分布研究的報道。本文在前期提取物研究［6，9］的基礎(chǔ)上，用AB-8型大孔樹脂分離宣木瓜75%乙醇提取物，收集不同濃度乙醇洗脫液，采用理化反應檢識洗脫液中的成分群，用分光光度法、高效液相色譜法定量測定不同洗脫部位主要活性成分含量，旨在為宣木瓜有效部位制備和資源綜合利用積累實驗資料和科學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀(包括G1311A泵、G1322脫氣機、G1313AZ自動進樣器、G1313A柱溫箱、G1315 DAD;ChemStation色譜工作站);BP211D電子天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司);KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司);Milli-Q Advantage超純水機(美國Millipore公司);765MC UV-vis(上海精密科學儀器有限公司分析儀器總廠)。

1.2 試劑 沒食子酸，齊墩果酸、熊果酸、綠原酸、原兒 茶 酸(批 號 110831-200302，110709-200505，110712-200508，110753-200413，110809-200604)對照品由中國藥品生物制品檢定所提供;AB-8型大孔樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司，凈品型);甲醇、乙腈為色譜純，乙醇為食品級，其余試劑均為分析純，實驗所用水為超純水。

1.3 藥材 宣木瓜于2013年7月中旬采自安徽省宣城市新田鎮(zhèn)宣木瓜種植基地，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學彭華勝教授鑒定為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai的果實;采后即置沸水中燙至表皮灰白色，對半縱剖，曬干，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 醇提物的制備 稱取宣木瓜樣品粉末10 kg，加75%乙醇120 L，70℃回流提取2 h，過濾，濾渣再用相同溶劑等量提取1次，合并濾液，減壓濃縮至膏狀，60℃微波干燥50 min，得到2.8 kg醇提物。

2.2 AB-8大孔吸附樹脂各極性部位制備

2.2.1 大孔樹脂預處理及裝柱 取凈品級別AB-8樹脂置無水乙醇浸泡24 h至充分溶脹，濕法裝柱，樹脂床徑高比為1∶3，用蒸餾水洗至無醇味，備用。

2.2.2 上樣溶液的制備 稱取2.1項下醇提物適量，置具塞錐形瓶中，加入75%乙醇適量，搖勻，放置過夜，超聲(40 kHz，250 W)30 min，2 000 r/min，離心30 min，上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇濃縮至合適濃度，備用。

2.2.3 最佳上樣濃度試驗 取AB-8樹脂40 mL，按2.2.1項下處理后裝柱，取宣木瓜醇提物適量，按2.2.2項下方法處理，分別制得濃度為0.112，0.168，0.224，0.28 g/mL的上樣溶液20 mL，調(diào)節(jié)流出閥控制流出液速度，以3 mL/min流速上樣;分別用3 BV的水，30%乙醇，50%乙醇，95%乙醇依序洗脫，洗脫流速為3 mL/min;收集洗脫液，水浴蒸干，減壓干燥至恒定重量。比較95%乙醇洗脫部位的得率，分別為1.15%，1.76%，0.79%，1.18%，故確定醇提物濃度為0.168 g/mL為最佳上樣濃度。

2.2.4 動態(tài)吸附曲線 取宣木瓜醇提物26.88 g，按2.2.2項下方法處理得到上樣液160 mL，緩緩加入40 mL AB-8樹脂柱中，調(diào)節(jié)流出閥控制流出流速為3 mL/min，每10 mL收集1分，依據(jù)前期試驗及流出液檢識反應結(jié)果，采用HPLC法［9］測定流出液中已知活性成分含量，結(jié)果表明，原兒茶酸、綠原酸在大孔樹脂柱上較早出現(xiàn)泄漏現(xiàn)象，原兒茶酸在第5管即出現(xiàn)泄漏。通過original軟件繪制動態(tài)吸附曲線。由此可知1 mL樹脂負載0.168 g醇提物為最佳量。

2.2.5 各極性部位的制備 取500 g宣木瓜醇提物，按2.2.2項下制備濃度為0.168 g/mL上樣液，緩緩加入600 mL AB-8樹脂中，分別用水，30%乙醇，50%乙醇，95%乙醇各3 BV依序洗脫，洗脫流速3 mL/min，收集洗脫液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，水浴蒸干，減壓干燥至恒定重量，計算得率;平行制備3份，結(jié)果見表1。將制備所得各極性部位密封，置陰涼處保存，備用。

2.3 各極性部位的成分檢識 分別稱取2.2.5項下所得的不同極性部位各0.5 g置5 mL容量瓶中，加甲醇適量超聲溶解，放冷，定容。在試管或點滴板上對不同部位進行理化檢識［10］，根據(jù)各類成分特有化學反應產(chǎn)生的顏色、沉淀等，進行定性試驗，以了解不同部位中可能含有的化學成分類型，其結(jié)果見表1。可知洗脫液均未檢出生物堿、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)及黃酮類成分;水，30%乙醇洗脫液檢出糖和苷類及香豆素類結(jié)構(gòu)的成分;30%，50%乙醇洗脫液檢出有酚類成分;50%，95%乙醇洗脫液檢出甾體或三萜類成分，進一步泡沫試驗顯示為三萜類?？瞻自囼灲Y(jié)果均呈陰性，表明樹脂和試劑對檢識反應無干擾。

2.4 各極性部位主要成分的含量測定 由檢識反應結(jié)果可知，AB-8大孔樹脂能夠較好的分離宣木瓜醇提物中多糖、多酚、三萜類成分。參照文獻［9］，分別以硫酸-苯酚法、福林-酚法、HPLC法定量測定各部位中總多糖、總多酚、原兒茶酸及綠原酸、齊墩果酸及熊果酸的含量。

2.4.1 總多糖的測定

表1 洗脫液成分檢識試驗結(jié)果

2.4.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品10.60 g，置于50 mL量瓶中，加水溶解、稀釋至刻度，得每1 mL含葡萄糖0.212 mg的對照溶液。

2.4.1.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取2.2.5項下所得的不同極性部位各0.3 g，置于錐形瓶中，精密加水30 mL，超聲(250 W，40 kHz)30 min，冷卻至室溫，稱重，加水補足減失的重量，抽濾，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液2～10 mL離心管中，加無水乙醇8 mL;離心(4 000 r/min)1 h，棄去上清液，沉淀加水溶解，定容至25 mL量瓶中，備用。

2.4.1.3 標準曲線的繪制 精密量取葡萄糖對照品溶液0.10，0.20，0.40，0.80，1.00 mL 至具塞試管中，加水補足至1.0 mL，加5%苯酚1.0 mL，混勻，加濃硫酸6.0 mL，立即搖勻，沸水浴10 min，冷卻至室溫，以相應試劑溶液為空白，在485 nm處測吸光度，以吸光度(Y)為縱坐標，葡萄糖溶液濃度(X)為橫坐標，建立回歸方程:Y=4.261X+0.114，r=0.999 4，表明葡萄糖濃度在9.92～99.20 μg/mL與吸光度線性關(guān)系良好。

2.4.1.4 樣品總多糖含量測定 精密稱取供試品，按2.4.1.2項下制備供試品溶液，精密量取2.0 mL，按2.4.1.3項下操作，自“加5%苯酚1.0 mL”起，在485 nm處測吸光度，利用標準曲線法計算各極性部位總多糖的含量。結(jié)果見表2。

2.4.2 總多酚的測定

2.4.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的沒食子酸對照品1.72 mg，置5 mL棕色量瓶中，加水溶解、稀釋至刻度，得每1 mL含沒食子酸0.344 mg的對照溶液。

2.4.2.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取2.2.5項下所得的不同極性部位各0.15 g，置于錐形瓶中，精密加水30 mL，放置過夜，超聲(250 W，40 kHz)10 min，濾過，棄去初濾液，續(xù)濾液備用。

2.4.2.3 標準曲線的繪制 分別精密量取沒食子酸對照品溶液 0.030，0.070，0.20，0.40，0.80，1.0 mL 至25 mL量瓶中，加磷鉬鎢酸1.0 mL，再加水至13 mL，用7.5%Na2CO3定容至刻度，暗處放置3 h，以相應試劑溶液為空白，在763 nm處測定吸光度，以吸光度(Y)為縱坐標，沒食子酸溶液濃度(X)為橫坐標，建立回歸方程:Y=114.8X+0.103，r=0.999 5，沒食子酸濃度在0.386～12.9 μg/mL與吸光度線性關(guān)系良好。

2.4.2.4 樣品含量測定 精密稱取供試品，按2.4.2.2項下制備供試品溶液，精密量取2.0～25 mL量瓶中，按 2.4.2.3項下操作，自“加磷鉬鎢酸1.0 mL”起，在763 nm處測定吸光度，利用標準曲線法計算總多酚含量。結(jié)果見表2。

2.4.3 原兒茶酸和綠原酸的測定

2.4.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 Shim-pack-CLC-ODS(M)色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，乙腈-0.1%磷酸水溶液(15∶85)為流動相，流速0.6 mL/min;柱溫25℃，檢測波長260 nm/325 nm，進樣量20 μL。在上述色譜條件下，原兒茶酸理論塔板數(shù)在4 000以上，與相鄰組分色譜峰均達到完全分離，分離度大于1.5。

2.4.3.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取原兒茶酸對照品0.53 mg，綠原酸對照品0.69 mg，置于同一5 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得原兒茶酸濃度為0.106 mg/mL、綠原酸濃度為0.138 mg/mL的混合對照品。

2.4.3.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取2.2.5項下所得的不同極性部位各0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(250 W，40 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，過0.45 μm濾膜，備用。

2.4.3.4 樣品含量測定 精密稱取供試品，按2.4.3.3項下制備供試品溶液，按2.4.3.1項下的色譜條件，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，按外標一點法計算原兒茶酸和綠原酸含量。結(jié)果見表2。

2.4.4 齊墩果酸和熊果酸的測定

2.4.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 Shim-pack-CLC-ODS(M)色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，甲醇-水-冰乙酸-三乙胺(265∶35∶0.1∶0.05)為流動相，流速0.6 mL/min;柱溫20℃，檢測波長210 nm，進樣量10 μL。在上述色譜條件下，齊墩果酸理論塔板數(shù)在15 000以上，齊墩果酸和熊果酸分離度達1.6。

2.4.4.2 對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對照品和熊果酸對照品適量，分別置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解、稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.052 0 mg/mL的齊墩果酸對照溶液及0.125 mg/mL的熊果酸對照溶液。

2.4.4.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取2.2.5項下所得的不同極性部位各0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲(250 W，40 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過0.45 μm濾膜，備用。

2.4.4.4 樣品含量測定 精密稱取供試品，按2.4.4.3項下制備供試品溶液，按2.4.4.1項下的色譜條件，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，按外標一點法計算齊墩果酸和熊果酸含量。結(jié)果見表2。

表2 各極性部位得率及含量 %

3 討論

本研究通過定性定量分析，明確了經(jīng)AB-8大孔樹脂分離的不同極性部位主要代表性成分;并在一次系統(tǒng)分離中對多糖、多酚和三萜酸均獲得了有效的分離和富集。結(jié)果顯示，宣木瓜藥材75%乙醇提取物經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂分離，可有效獲得主要成分明確的三個極性部位:多糖類成分主要集中在水洗脫液中;多酚類成分主要集中在30%～50%乙醇洗脫液中;齊墩果酸、熊果酸等三萜類成分主要集中在95%乙醇洗脫液中，平行三份操作表明該方法具有良好的可重復性。

黃酮類成分被認為是木瓜的活性成分［11］，但本試驗的化學鑒別及HPLC方法均未能在宣木瓜醇提物和各洗脫液中檢識到文獻報道的黃酮類成分，究其原因，一方面文獻對黃酮類的分析多采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法［12］，該方法對黃酮的顯色專屬性不強［13］，誤將多酚成分作為黃酮測定;另一方面可能是黃酮的存在形式和含量的原因，有待進一步研究。

由于篇幅所限，本文略去含量測定的方法學內(nèi)容。多糖、多酚含量測定方法經(jīng)典;原兒茶酸和綠原酸含量測定的方法學未在此贅述(另文發(fā)表)。齊墩果酸和熊果酸含量測定的方法學驗證見文獻［14］。

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