殷章紅，羅鵬程，王才英

(黃石市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北黃石435000)

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)是哺乳類動(dòng)物絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族成員之一，其在體內(nèi)可以使得某些沒有活性的蛋白中的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而使得這些蛋白發(fā)揮相應(yīng)的功能。目前多數(shù)研究［1-2］認(rèn)為，JNK信號(hào)通路中的調(diào)節(jié)酶類參與了肥胖、胰島素抵抗以及2型糖尿病等疾病的發(fā)生和發(fā)展。橙皮苷在藥學(xué)上又稱之為陳皮甙、桔皮甙，其是橙皮、檸檬中提取的一種苷類活性物質(zhì)，臨床研究［3］表明橙皮苷具有較強(qiáng)的抗氧化能力。本文擬用橙皮苷治療2型糖尿病大鼠，著重分析治療后對(duì)JNK信號(hào)通路的特點(diǎn)，以探討其是否可以作為一種輔助治療2型糖尿病的藥物。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)雄性SD大鼠36只，大鼠體質(zhì)量(190±10)g，由廣東藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào):26-2003A003)。橙皮苷購(gòu)自四川康嘉生物科技有限公司。JNK、P-JNK多克隆抗體、相應(yīng)二抗、β-actin單克隆鼠抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Craze公司;多克隆抗體Caspase-6抗體購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京天根生物公司。

1.2 模型建立及大鼠分組 40只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組12只，模型組14只以及橙皮苷治療組14只，造模時(shí)空白對(duì)照組給予其正常飼料喂養(yǎng)，模型組和橙皮苷治療組給予日常高脂飼料(普通飼料78.8%，膽固醇1%，牛膽鹽0.2%，蛋黃粉10%，豬油10%)飲食加高濃度紅糖水(5%)飲用，6個(gè)月后用血糖儀測(cè)定血糖，測(cè)定時(shí)隨機(jī)選取大鼠，連續(xù)3 d，大鼠血糖含量均大于11.1 mol/L時(shí)確認(rèn)造模成功。

1.3 標(biāo)本收集 治療組給予橙皮苷200 mg/kg大鼠體質(zhì)量灌胃，模型組給予生理鹽水1 mL灌胃對(duì)應(yīng)比較，對(duì)照組不給于任何干涉，治療8周后大鼠頸椎脫臼處死，之后用剪刀沿大鼠腹中線切開，取肝臟組織置超低溫冰箱保存。

1.4 免疫組化 JNK、P-JNK免疫組化交由廣東藥學(xué)院病理學(xué)院完成，Caspase-6免疫組化由我院病理科完成，具體方法參照PV.9000二步法免疫組織化學(xué)試劑盒說明書，肝臟組織在用4%的多聚甲醛固定后，分別用15%和25%的蔗糖溶液梯度脫水24 h，冰凍切片后用3%H2O2阻斷，血清封閉，之后分別滴加1∶200稀釋的克隆一抗，4℃孵育過夜，第2天滴加相應(yīng)二抗和辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育10 min后，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇梯度脫水，二甲苯透明即完成，最后顯微鏡觀察并保存圖像，觀察分析結(jié)果。

1.5 Western Blot檢測(cè) 取1 g肝臟組織，磨碎后提取上清液離心提取上清液，蛋白定量，取各樣本100 μg行聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳，暗室內(nèi)曝光洗片，掃描儀掃描膠片圖像、Image J計(jì)算各灰度值，βactin作內(nèi)參對(duì)照。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 用總RNA提取試劑盒提取肝臟組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。JNK基因上游引物:5’-ACAGTGAGCAGAGCAGGCATAGTG-3’。下游引物:5’-TCCTCCCCAAA CAAA-ATAGAACCA-3’，產(chǎn)物為520bp;P-JNK基因上游引物:5’-TCAGGCAGT AGCACCGCGA-GAGTA-3’。下游引物:5’-GCATGCACCAGATACTACGACCG-3’，產(chǎn)物為 436bp;Caspase-6基因上游引物:5’-GCGGTGAGCAAGTGGCAGCCAGTG-3’。下游引物:5’-TCTACCGTAC AGAGTGATAAAGCA-3’，產(chǎn)物為 356 bp;β-actin 基因上游引物:5’-CAGGTCCA-GACGCAGGATGGC-3’。下游引物:5’-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3’，產(chǎn)物為 270 bp。取5 μL cDNA和相應(yīng)引物擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為預(yù)變性5 min，擴(kuò)增40次，擴(kuò)增完成后直接凝膠電泳，收集圖像后，Image J計(jì)算各灰度值，β-actin作內(nèi)參對(duì)照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化 免疫組化JNK、P-JNK、Caspase-6，其對(duì)照組肝組織內(nèi)幾乎未見棕色顆粒。模型組肝組織內(nèi)棕色顆粒明顯增多;橙皮苷治療組肝組織內(nèi)棕黃色顆粒較模型組減少，但仍然較高。

2.2 RT-PCR RT-PCR結(jié)果可以明顯的看出，JNK、P-JNK以及Caspase-6空白組表達(dá)較低，經(jīng)橙皮苷治療后，3個(gè)蛋白表達(dá)有一定的降低，明顯低于模型組(P＜0.05)，但與空白組仍然有較遠(yuǎn)的差距(P＜0.05)。

2.3 Western blot Western blot與RT-PCR結(jié)果一致，JNK、P-JNK以及Caspase-6空白組表達(dá)較低，經(jīng)橙皮苷治療后，3個(gè)蛋白表達(dá)有一定的降低，明顯低于模型組(P＜0.05)，但與空白組仍然有較遠(yuǎn)的差距(P＜0.05)。

2.4 胰島素抵抗指數(shù) 胰島素抵抗指數(shù)比較，橙皮苷治療后，明顯低于模型組(P＜0.05)，但與空白對(duì)照組相比，仍有一定的差距(P＜0.05)，見圖1。

圖1 治療后大鼠胰島素抵抗指數(shù)的表達(dá)

3 討論

2型糖尿病是臨床中最為常見的一種代謝性疾病，近年來隨著人們生活水平的提高，本病的發(fā)生率逐年升高［4］。有研究［5］顯示，本病在我國(guó)發(fā)病人數(shù)已超過9 000萬。2型糖尿病最典型的特征為胰島素抵抗(IR)的升高，此病雖機(jī)體內(nèi)胰島素可以正常產(chǎn)生，但是由機(jī)體對(duì)其敏感性降低所產(chǎn)生［6］。主要是由于胰島素受體底物以及磷脂酰肌醇3激酶途徑發(fā)生異常在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)中起到關(guān)鍵作用，而JNK信號(hào)通路屬于本轉(zhuǎn)運(yùn)通路的一環(huán)，與IR的發(fā)生密切相關(guān)［7］。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［8-9］發(fā)現(xiàn)，不管在高脂飲食誘導(dǎo)的還是基因敲除(ob/ob)的肥胖鼠中，其胰島素作用的靶器官肝臟、骨骼肌、脂肪組織中JNK活性均明顯增高，而激活JNK使其磷酸化活性形式的表達(dá)也明顯升高。JNK在體內(nèi)可以使得某些沒有活性的蛋白中的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而使得這些蛋白發(fā)揮相應(yīng)的功能。目前多數(shù)研究［1-2］認(rèn)為，JNK信號(hào)通路中的調(diào)節(jié)酶類參與了肥胖、胰島素抵抗以及2型糖尿病等疾病的發(fā)生和發(fā)展。

橙皮苷在攝入人體后，有維持血液滲透壓，增強(qiáng)毛細(xì)血管韌性作用，同時(shí)還有降低膽固醇，調(diào)節(jié)脂代謝的作用［10］。目前本藥多用于心血管系統(tǒng)疾病的輔助治療，具有明顯的預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化以及預(yù)防心肌梗死的作用［11］。研究中用橙皮苷治療2型糖尿病大鼠，著重分析治療后對(duì)JNK信號(hào)通路的影響，以探討其是否可以作為一種輔助治療2型糖尿病的藥物。研究結(jié)果顯示，橙皮苷治療后大鼠肝臟免疫組化、蛋白以及 mRNA JNK、P-JNK、Caspase-6表達(dá)，3個(gè)指標(biāo)均有一定的降低，明顯低于模型組(P＜0.05)，但與空白組仍然有較遠(yuǎn)的差距(P＜0.05)。胰島素抵抗指數(shù)與蛋白表達(dá)結(jié)果基本一致。

綜上提示:橙皮苷可改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗指數(shù)，其可能是通過抑制JNK信號(hào)通路的活性，減少JNK、p-JNK以及Caspase-6表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，但橙皮苷降低上述酶及表達(dá)幅度較小，今后可用于輔助用藥。

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