林 燕， 鮑 斌

（合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

木犀草素抑制3T3－L1前脂肪細(xì)胞的分化

林 燕， 鮑 斌

（合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

為研究木犀草素在3T3－L1前脂肪細(xì)胞成脂分化過(guò)程中的作用，文章探討木犀草素抑制脂質(zhì)沉積的作用機(jī)制，選取3T3－L1前脂肪細(xì)胞作為研究對(duì)象，在其分化過(guò)程中添加木犀草素，利用噻唑藍(lán)（MTT）實(shí)驗(yàn)研究木犀草素對(duì)3T3－L1增殖的作用；利用油紅O染色確定其對(duì)3T3－L1前脂肪細(xì)胞脂肪化的影響；利用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)木犀草素對(duì)3T3－L1脂肪化相關(guān)基因的表達(dá)影響。結(jié)果表明，20μmol／L的木犀草素可以降低3T3－L1細(xì)胞的脂肪化，減少脂質(zhì)聚集，并且降低了3T3－L1細(xì)胞中脂肪化相關(guān)基因Pparγ、C／EBPα、Ap2和Fas等基因的表達(dá)。

木犀草素；3T3－L1脂肪細(xì)胞；成脂分化；細(xì)胞增殖；基因表達(dá)

0 引 言

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活方式的改變，肥胖作為一種全球性代謝疾病，在世界范圍內(nèi)迅速蔓延，并與多種疾病相關(guān)，危害著人類(lèi)健康，其中包括Ⅱ型糖尿病、高血壓、心血管疾病、粥樣動(dòng)脈硬化以及癌癥［1－2］等。在肥胖發(fā)生過(guò)程中，脂肪細(xì)胞增生和增大導(dǎo)致脂肪組織中脂質(zhì)過(guò)多累積，在脂質(zhì)積累到一定限度后，會(huì)使得過(guò)量的脂質(zhì)向非脂組織轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致這些正常代謝器官的病變，危害人類(lèi)健康。因此，在肥胖過(guò)程中，有效抑制脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)積累是一種重要的抵抗肥胖的手段［3］。

黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)植物界普遍存在的多酚化合物，因?yàn)閷?duì)人類(lèi)的健康有益，而獲得了廣泛關(guān)注［4－5］。木犀草素是一種天然的黃酮類(lèi)化合物，在多種可食用的植物中含量豐富，如芹菜、胡蘿卜、香菜、辣椒及菠菜等［6］。木犀草素在中國(guó)傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)中主要被用于治療炎癥性疾病，如高血壓和癌癥等［6－7］。木犀草素可以通過(guò)口服給藥吸收，在血漿中可以檢測(cè)到低濃度的游離的木犀草素［8］，同時(shí)，由于其生物利用度較高及代謝率較低，使得木犀草素可以在體內(nèi)安全地發(fā)揮其生物活性［6］。

已有一系列體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了木犀草素能夠有效改善肥胖及與肥胖相關(guān)的胰島素抵抗，包括飲食誘導(dǎo)的肥胖、基因缺陷導(dǎo)致的肥胖和化學(xué)誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物中胰島素敏感性［9－15］。但木犀草素對(duì)脂肪細(xì)胞分化及相關(guān)基因表達(dá)影響的研究并不多，因此，本文擬采用3T3－L1前脂肪細(xì)胞作為研究對(duì)象，研究木犀草素對(duì)脂肪細(xì)胞分化的作用，檢測(cè)并分析木犀草素的減肥降糖作用機(jī)理，并從基因的轉(zhuǎn)錄水平研究其調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

3T3－L1脂肪細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心，木犀草素、IBMX（異丁基甲基黃嘌呤）、胰島素、地塞米松、油紅O染液購(gòu)買(mǎi)自Sigma公司，胎牛血清（FBS）、新生牛血清（NBS）、DMEM（細(xì)胞培養(yǎng)基）高糖培養(yǎng)基購(gòu)買(mǎi)自GIBCO公司，RNAiso Plus試劑、Oligo d（T）18、dNTP 、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑購(gòu)買(mǎi)自TaKaRa公司，M－MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)買(mǎi)自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

3T3－L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞用含10%NBS的DMEM高糖培養(yǎng)液在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，直至細(xì)胞生長(zhǎng)接近80%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化，接到24孔板中備用。

1.2.2 木犀草素對(duì)3T3－L1增殖的作用

胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)至（5～10）×104個(gè)／m L，于96孔板中，每孔接種細(xì)胞100μL，加入一定濃度的木犀草素。5%CO2、37℃孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。每孔加入10μL質(zhì)量濃度為5 g／L噻唑藍(lán)溶液（MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。結(jié)晶可充分形成，將上清液去掉，每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。

1.2.3 3T3－L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化

將3T3－L1細(xì)胞接種到24孔板中進(jìn)行誘導(dǎo)分化。融合后2 d進(jìn)行第1次誘導(dǎo)，加入含10%FBS、10μg／m L Insulin、0.5 mmol／L IBMX 和1μmol／L DEXA的DMEM。2 d后第2次誘導(dǎo)加入含10%FBS、10μg／m L Insulin的DMEM，然后用含10%FBS的DMEM維持4 d。20μmol／L的木犀草素在每次誘導(dǎo)時(shí)都同時(shí)加入，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.4 油紅染色

誘導(dǎo)分化8 d后的3T3－L1吸出培養(yǎng)基，用磷酸藍(lán)緩沖液（PBS）洗2遍，4%的甲醛暗處1 h固定細(xì)胞，然后用無(wú)菌水洗2遍，再用100%的1，2－丙二醇潤(rùn)洗2 min，加入0.5%油紅染色暗處4 h，染色結(jié)束后，吸出染液，加入98%的1，2－丙二醇。85%丙二醇于脫色搖床上搖晃5 min 3次，加入1×PBS，倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況并拍照。拍照完成后吸凈PBS，加入200μL無(wú)水乙醇，于脫色搖床搖晃5 min，使油紅溶出。每孔吸出150μL于96孔板中，檢測(cè)OD510。

1.2.5 q－PCR檢測(cè)成脂分化基因的表達(dá)

收集各組誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞，用RNAiso Plus試劑提取總RNA，取2μg總RNA利用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄成c DNA，并用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法檢測(cè)成脂相關(guān)基因的m RNA表達(dá)，PCR各基因引物見(jiàn)表1所列。以GAPDH作為內(nèi)參照，分別計(jì)算各組2－ΔΔCT，用以表示Pparγ、C／EBPα、Ap2和Fas mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 定量PCR的引物序列

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示（重復(fù)3次試驗(yàn)，每組4孔細(xì)胞）。由SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行不同組之間的t檢驗(yàn)，雙側(cè)P＜0.05為顯著差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 木犀草素對(duì)3T3－L1增殖的影響

利用MTT方法研究木犀草素對(duì)3T3－L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響，如圖1所示。

圖1 木犀草素對(duì)3T3－L1細(xì)胞增殖的影響

由圖1可看出，較低濃度的木犀草素并不影響細(xì)胞的增殖，說(shuō)明較低濃度的木犀草素對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)不產(chǎn)生影響。而本文研究的木犀草素對(duì)3T3－L1的脂細(xì)胞分化的作用是以不影響3T3－L1的正常生長(zhǎng)為前提的，因此本文選擇了20μmol／L的木犀草素為研究對(duì)象。

2.2 木犀草素對(duì)3T3－L1分化的作用

在3T3－L1誘導(dǎo)分化過(guò)程中加入20μmol／L的木犀草素培養(yǎng)8 d，利用油紅O染色后的顯微組織，如圖2所示，由圖2可知，20μmol／L的木犀草素能夠抑制3T3－L1脂肪細(xì)胞的成脂過(guò)程，被染色的脂滴的含量明顯減少。3T3－L1誘導(dǎo)分化后8 d油紅O染色的吸光度結(jié)果如圖3所示。

在510 nm吸收波長(zhǎng)下檢測(cè)光密度的結(jié)果表明，木犀草素對(duì)3T3－L1細(xì)胞脂肪化有顯著的抑制作用。

圖2 3T3－L1誘導(dǎo)分化后8 d油紅O染色的顯微組織

圖3 3T3－L1誘導(dǎo)分化后8 d油紅O染色的吸光度

2.3 木犀草素對(duì)脂肪化相關(guān)基因表達(dá)影響

C／EBPα（CCAT 增 強(qiáng) 子 結(jié) 合 蛋 白 α）和PPARγ（過(guò)氧化質(zhì)體增殖激活受體γ）是3T3－L1細(xì)胞脂肪化的關(guān)鍵調(diào)控因子。AP2（脂肪細(xì)胞質(zhì)結(jié)合蛋白）則是C／EBPα和PPARγ下游的目標(biāo)基因，與成熟脂肪細(xì)胞的維持有關(guān)［11］。Fas（脂肪酸合成酶）是脂肪細(xì)胞內(nèi)的主要酶。在誘導(dǎo)3T3－L1前脂肪細(xì)胞成脂分化過(guò)程中，加入20μmol／L的木犀草素處理8 d后顯著抑制了這些脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的基因m RNA的表達(dá)，如圖4所示。

圖4 20μmol／L木犀草素對(duì)3T3－L1脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

圖4表明，木犀草素可以通過(guò)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄 表達(dá)抑制3T3－L1前脂肪細(xì)胞的成脂過(guò)程。

3 討 論

肥胖是一種營(yíng)養(yǎng)和能量過(guò)剩引起的慢性低度炎性疾病，伴隨著各種炎性因子和抗炎因子分泌的失衡。脂肪組織，尤其是白色脂肪組織，不單儲(chǔ)存能量，更具有重要的內(nèi)分泌和免疫調(diào)節(jié)功能。其中，脂肪細(xì)胞參與能量代謝的調(diào)節(jié)在肥胖和其他慢性代謝疾病產(chǎn)生中起到重要作用［16］。預(yù)防和治療肥胖的主要措施包括控制飲食、增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)、補(bǔ)充功能性減肥食品、藥物治療和手術(shù)等。許多食品原料和天然產(chǎn)物能調(diào)節(jié)人體能量代謝平衡，改善脂肪組織功能，起到減肥的效果，是開(kāi)發(fā)安全有效的功能性減肥食品的豐富資源，包括膳食纖維、茶葉、苦瓜、柑橘提取物、大豆皂甙、藍(lán)莓、辣椒素、姜黃素、共軛亞油酸等［17］。

木犀草素是一種重要的黃酮類(lèi)物質(zhì)，大量的報(bào)道顯示木犀草素對(duì)糖尿病、肝臟脂肪沉積和代謝綜合癥具有有效的改善作用［9－15］。本實(shí)驗(yàn)以3T3－L1細(xì)胞為研究對(duì)象，研究木犀草素對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在3T3－L1脂肪分化的過(guò)程中添加不影響3T3－L1正常分化的20μmol／L木犀草素可以降低脂質(zhì)的沉積，油紅O染色結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)脂滴聚集明顯減少。此外，20μmol／L木犀草素也降低了脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C／EBPα（CCAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α）和PPARγ（過(guò)氧化質(zhì)體增殖激活受體γ）的表達(dá)。而 AP2（脂肪細(xì)胞質(zhì)結(jié)合蛋白）則是C／EBPα和PPARγ下游的目標(biāo)基因，與成熟脂肪細(xì)胞的維持有關(guān)，木犀草素的處理也顯著降低了Ap2的表達(dá)。因此木犀草素對(duì)Ap2的抑制作用可能與下調(diào)Pparγ和C／EBPα基因表達(dá)有關(guān)。Fas（脂肪酸合成酶）是脂肪細(xì)胞內(nèi)主要的酶，木犀草素的處理也顯著降低了Fas的表達(dá)，說(shuō)明木犀草素確實(shí)降低了3T3－L1細(xì)胞的成脂分化。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)證明了適當(dāng)濃度的木犀草素能通過(guò)下調(diào)Pparγ、C／EBPα、Ap2和Fas基因表達(dá)來(lái)抑制3T3－L1細(xì)胞的成脂分化。木犀草素能夠直接抑制脂肪細(xì)胞成脂分化，為其在降低肥胖中的作用提供了依據(jù)。

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Inhibiting the differentiation of 3T3－L1 adipocytes by luteolin

LIN Yan， BAO Bin
（School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

In order to study the effect of luteolin on the differentiation of 3T3－L1 adipocytes，and the mechanism of inhibitory effect of luteolin on lipid deposition，luteolin was added into the medium of 3T3－L1 during differentiation.After differentiation，the effect of luteolin on 3T3－L1 proliferation was observed through MTT，and the effect on fat deposition was detected by oil red O staining.In addition，the expression of the genes during 3T3－L1 differentiation was determined by quantitative reverse transcription－polymerase chain reaction（RT－PCR）.The results show that luteolin of 20μmol／L can reduce 3T3－L1 adipocyte fat deposition，and decrease the expression of Pparγ，C／EBPα，Ap2 and Fas.

luteolin；3T3－L1 adipocytes；differentiation；cell proliferation；gene expression

Q254

A

1003－5060（2015）02－0254－04

10.3969／j.issn.1003－5060.2015.02.024

2014－02－21；

2014－03－20

中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2013M541817）；合肥工業(yè)大學(xué)青年教師創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目（2012HGQC0019）

林 燕（1986－），女，安徽蚌埠人，合肥工業(yè)大學(xué)碩士生；

鮑 斌（1983－），男，河北石家莊人，博士，合肥工業(yè)大學(xué)講師.

（責(zé)任編輯 閆杏麗）