李 帥， 劉軍軍， 安紅鋼， 吳冬青

（河西學院化學化工學院，甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅張掖734000）

黑柴胡黃酮純化及其與維生素C、蘆丁協(xié)同抗氧化作用

李 帥， 劉軍軍， 安紅鋼， 吳冬青*

（河西學院化學化工學院，甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅張掖734000）

目的通過NKA-Ⅱ大孔吸附樹脂對黑柴胡黃酮進行分離純化，并探究純化物與維生素C（VC）和蘆丁的復配抗氧化作用。方法以靜態(tài)吸附率和解吸率為指標，確定黑柴胡黃酮純化工藝，并應用·DPPH清除實驗和等輻射分析法（Isobologram）研究復配抗氧化作用。結(jié)果NKA-Ⅱ大孔吸附樹脂純化黑柴胡黃酮的最佳條件為pH 2，黃酮質(zhì)量濃度0.608 4 mg/m L，70 mL 60%乙醇溶液洗脫。在此條件下，樹脂富集倍數(shù)達5.05倍。清除·DPPH能力為VC＞VC樣品復配組＞蘆丁樣品復配組＞蘆?。敬痔嵋海炯兓?。結(jié)論純化物與VC和蘆丁間存在協(xié)同抗氧化作用。

黑柴胡；黃酮；純化；協(xié)同抗氧化作用

黑柴胡Bupleurum smithii Wolff為傘形科柴胡屬多年生草本植物［1］，味苦，性微寒，主要分布于河北、山西、陜西、河南、甘肅、青海、內(nèi)蒙古等地區(qū)。其化學成分主要為柴胡皂苷、甾醇、揮發(fā)油、多糖、黃酮等［2］，可用于治療感冒發(fā)熱、胸部擴張?zhí)弁?、月?jīng)不調(diào)等病癥，具有解熱、抗炎、抗病毒感染、免疫調(diào)節(jié)等功效［2-3］。目前，張如意等［4］從黑柴胡中鑒定出2種新的柴胡皂苷——柴胡皂苷m和柴胡皂苷n；楊瑤珺等［5］從黑柴胡中提取出揮發(fā)油成分，并通過GC-MS技術(shù)鑒定出36個化合物；陳喜奎等［6］從黑柴胡根中分得柴胡次皂苷A、D，柴胡皂苷b1、b2、g及柴胡皂苷元A；劉秀芳等［7］以·DPPH、·OH、O2-·清除為體系，研究小葉黑柴胡莖葉總黃酮的抗氧化性。但是目前對黑柴胡的研究主要集中于成分分析，而對其黃酮類化合物協(xié)同抗氧化作用的研究較少。有報道稱，復合抗氧化劑相比單一抗氧化劑，具有活性高、成本低等優(yōu)點，同時可避免高劑量時帶來的食品安全問題［8］。本實驗采用NKA-Ⅱ大孔吸附樹脂對黑柴胡黃酮進行純化，以·DPPH清除實驗和等輻射分析法研究黑柴胡黃酮純化物與VC、蘆丁協(xié)同抗氧化作用，旨在為黑柴胡的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 黑柴胡于2013年采自甘肅隴西，粉碎備用。

NKA-Ⅱ、XDA-1、NKA-9、LSA-21、LX-38、D4020、D4006大孔吸附樹脂 （南開大學化工廠）；蘆丁 （中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司，C27H30O16·3H2O≥95.0%）；·DPPH（梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）?？箟难幔╒C）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、丙酮、無水乙醇等均為分析純 （國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器 HH-4型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 （常州國華電器有限公司）；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠）；WFJ-2100型可見分光光度計 （尤尼柯儀器有限公司）；SHA-B型恒溫振蕩器（國華電器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 （鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 黑柴胡黃酮粗提液的制備 精密稱取黑柴胡粉末于250mL圓底燒瓶中，以料液比1∶30（g/mL）加入80%乙醇，70℃下回流提取1 h，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味，冷藏備用。

1.3.2 黃酮粗提液質(zhì)量濃度的測定 標準曲線采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法［9］，蘆?。?.235 0 mg/ mL）為對照品溶液，以蘆丁質(zhì)量濃度 （C）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標建立回歸方程A=11.079C-0.029，r=0.999 9，線性范圍0.009 4～0.056 4 mg/mL。

精密移取1.00 mL黃酮粗提液于25 m L量瓶中，80%乙醇定容。再精密移取2.00 mL，按標準曲線的方法測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算黃酮質(zhì)量濃度。

1.3.3 樹脂的預處理［10］稱取大孔吸附樹脂適量，按1∶10（g/mL）比例加入丙酮，50℃下回流3 h后過濾，樹脂用95%乙醇浸泡24 h后再過濾，蒸餾水洗滌至無醇味，依次用5%HCl和5%NaOH浸泡3 h，蒸餾水洗滌至中性，備用。

1.3.4 大孔吸附樹脂的篩選［11］

1.3.4.1 靜態(tài)吸附試驗 精密稱取預處理后的7種大孔吸附樹脂各1.000 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，分別加入0.2 mg/mL，pH為2的黃酮溶液30.00 mL，恒溫振蕩器上振蕩 （30℃，轉(zhuǎn)速150 r/min）吸附24 h，精密吸取1.00 mL上清液，測定黃酮質(zhì)量濃度，按下式計算吸附率。

注：C為吸附前溶液的總黃酮質(zhì)量濃度；C＇為吸附后溶液的總黃酮質(zhì)量濃度。

1.3.4.2 靜態(tài)解吸試驗 將吸附飽和的7種樹脂用蒸餾水淋洗后，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入95%的乙醇溶液50.00 mL，振蕩（50℃，轉(zhuǎn)速150 r/min）解吸24 h，精密吸取1.00mL解吸液，測定黃酮質(zhì)量濃度，按下式計算解吸率：

注：C為吸附前溶液的總黃酮質(zhì)量濃度；C＇為吸附后溶液的總黃酮質(zhì)量濃度；V為吸附液的體積；C″為解吸后溶液的總黃酮質(zhì)量濃度；V＇為解吸液的體積。

1.3.5 黑柴胡黃酮分離純化

1.3.5.1 pH對吸附率的影響［10］精密稱取最優(yōu)大孔吸附樹脂1.000 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入0.2 mg/mL，不同pH的黃酮溶液30.00 mL，于恒溫振蕩器上振蕩 （30℃，轉(zhuǎn)速150 r/min）吸附24 h，準確精密吸取1.00 mL上清液，測定黃酮質(zhì)量濃度，計算吸附率，確定最佳pH值。

1.3.5.2 靜態(tài)等溫吸附曲線［12］精密稱取最優(yōu)大孔吸附樹脂1.000 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入最佳pH，不同質(zhì)量濃度的黃酮液30.00 mL，恒溫振蕩器上振蕩（30℃，轉(zhuǎn)速150 r/min）吸附24 h，精密吸取1.00 mL上清液，測定黃酮質(zhì)量濃度，計算吸附率，繪制靜態(tài)等溫吸附曲線。

1.3.5.3 解吸劑的選擇［13］取最佳靜態(tài)吸附條件下所得飽和吸附樹脂，蒸餾水淋洗后，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入不同體積分數(shù)的乙醇溶液50.00 mL，振蕩 （50℃，轉(zhuǎn)速150 r/m in）解吸24 h，精密吸取1.00 mL解吸液，測定黃酮質(zhì)量濃度，計算解吸率，確定最佳解吸劑。

1.3.5.4 動態(tài)吸附-解吸試驗［12-13］精密稱取已處理好的最優(yōu)大孔吸附樹脂10 g，裝于層析柱中，徑高比為2∶8。將最佳pH和最優(yōu)質(zhì)量濃度的黃酮液以1 mL/min的體積流量過柱，使其充分透過樹脂柱 （當流出液質(zhì)量濃度為上柱黃酮液濃度的2/3時，可認為已透過）。再用8 BV蒸餾水沖洗樹脂柱，用靜態(tài)解吸實驗所得的最佳乙醇體積分數(shù)洗脫（體積流量1mL/min），每10.00mL為1份收集，測定吸光度，計算黃酮質(zhì)量濃度，繪制洗脫曲線。

1.3.5.5 純化效果檢驗［14］將黃酮粗提液及最佳條件下所得的純化液減壓濃縮，真空干燥。分別稱取各樣品0.1 g，60%乙醇溶解，定容至100 mL。根據(jù)標準曲線方法測定黃酮質(zhì)量濃度，計算樣品純度。

1.3.6 清除·DPPH實驗［15］

1.3.6.1 樣品液單一抗氧化作用 精密吸取不同質(zhì)量濃度的樣品液1.00 m L于試管中，加入100μg/mL的·DPPH溶液1.00mL，加水補充至5 mL，避光放置30 min后，在517 nm下測定吸光度，按下式計算純化前后黃酮液、VC、蘆丁對·DPPH清除率。

注：A0為未加樣品液的·DPPH溶液的吸光度；Ai為所測樣品液的吸光度；Aj為相應質(zhì)量濃度樣品液的本底吸光值。

1.3.6.2 純化物與VC、蘆丁復配抗氧化作用［16］以“1.3.6.1”項實驗所得的VC和蘆丁清除·DPPH的IC50值為參考，選擇VC和蘆丁-純化物 （質(zhì)量濃度比）為指標。按一定比例混合后，應用 “1.3.6.1”項方法測定復合液的清除率并計算其IC50值，繪制Isobologram分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑柴胡黃酮粗提液的質(zhì)量濃度 根據(jù) “1.3.2”項方法進行5次平行實驗，測得黃酮粗提液質(zhì)量濃度為2.538 mg/mL，RSD為0.7692%。

2.2 最優(yōu)大孔吸附樹脂的篩選 根據(jù) “1.3.4”項方法進行3次平行實驗，結(jié)果見表1。

表1 各種大孔樹脂的吸附率和解吸率

由表1可知，各種大孔樹脂間吸附率相當，均在80%～90%之間，而解吸率則相差較大，其中以NKA-Ⅱ大孔樹脂為最佳，達86.75%，而其他各樹脂均在80%以下。綜合考慮，本實驗選擇NKA-Ⅱ大孔樹脂為最優(yōu)樹脂。

2.3 靜態(tài)吸附-解吸條件

2.3.1 pH對吸附率的影響 根據(jù)“1.3.5.1”項的方法進行實驗，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，pH 2時，吸附率較高，但隨著pH增大，吸附率逐漸下降。推測可能是由于黃酮的多酚結(jié)構(gòu)使其具有一定酸性，在酸性條件下較易被樹脂吸附，而當溶液偏堿性時，黃酮分子的H+離子丟失，轉(zhuǎn)化為離子結(jié)構(gòu)，故不易被吸附［17］。因此，本實驗選擇最佳黃酮液pH為2。

2.3.2 靜態(tài)等溫吸附曲線 根據(jù) “1.3.5.2”項方法進行實驗，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著黃酮質(zhì)量濃度的增加，吸附率隨之增大。質(zhì)量濃度為0.608 4 mg/mL時，吸附率為91.81%；質(zhì)量濃度為0.811 2 mg/mL時，吸附率最高，達到92.97%；質(zhì)量濃度進一步增大時，吸附率增加趨勢變緩，說明樹脂吸附已經(jīng)達到飽和。另外，黃酮質(zhì)量濃度過大時會堵塞樹脂，也會造成其使用周期減少，再生次數(shù)增多［17-18］。考慮到圖 2所示的最大吸附率與質(zhì)量濃度為0.608 4 mg/mL時的吸附率相當，因此本實驗選擇最佳上樣質(zhì)量濃度為0.608 4 mg/mL。

圖1 pH對吸附率的影響

圖2 黃酮的靜態(tài)等溫吸附曲線

2.3.3 解吸劑的篩選 根據(jù) “1.3.5.3”項方法進行實驗，結(jié)果見圖3。

圖3 解吸劑的篩選

由圖3可知，不同體積分數(shù)的乙醇解吸能力有明顯差異。乙醇體積分數(shù)為60%時，解吸率可達95.26%；體積分數(shù)進一步增大時，解吸率增加趨勢變緩。從節(jié)約成本方面考慮，本實驗選擇60%乙醇作為解吸劑。

2.4 動態(tài)洗脫曲線 根據(jù) “1.3.5.4”項方法進行實驗，結(jié)果見圖4。

圖4 動態(tài)洗脫曲線

由圖4可知，NKA-Ⅱ大孔樹脂吸附的黃酮較易洗脫，當洗脫液體積為20 mL時，洗脫的黃酮質(zhì)量濃度最大；采用60%乙醇解吸時，洗脫峰較集中，對稱性好，無明顯拖尾現(xiàn)象，而且，只需70 mL左右就基本能將黃酮都洗脫下來。

2.5 NKA-Ⅱ樹脂純化效果 取黑柴胡粗提液適量，在優(yōu)選的工藝條件下分離純化黃酮，根據(jù) “1.3.5.5”項方法進行實驗。結(jié)果表明，粗提物黃酮的純度為11.40% （RSD為7.200%），經(jīng)樹脂純化后其純度可達57.58% （RSD為2.081%），即樹脂的富集倍數(shù)達5.05倍。由此可知，該工藝穩(wěn)定可靠，而且NKA-Ⅱ大孔吸附樹脂純化黑柴胡黃酮效果良好。

2.6 樣品抗氧化作用

2.6.1 黑柴胡黃酮抗氧化能力 根據(jù) “1.3.6.1”項方法進行實驗，結(jié)果見圖5。

圖5 樣品液清除·DPPH的能力

·DPPH是一種人工合成的以氮為中心的自由基，其分子中的3個苯環(huán)共振，從而形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而且它的醇溶液于517 nm處有強吸收。當往·DPPH溶液中加入樣品液時，若后者含有抗氧化成分，則·DPPH溶液將接收一個電子而紫色變淺，其褪色程度與抗氧化劑濃度呈正相關(guān)［19］。由圖5可知，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其清除率隨樣品質(zhì)量濃度的增大而上升，當粗提液和純化液的質(zhì)量濃度分別達到75和125μg/mL時，清除率基本不變，說明·DPPH基本上已完全清除。純化液、粗提液、VC、蘆丁清除·DPPH的IC50值依次為50.46、40.18、8.609、33.10μg/mL，即清除能力為VC＞蘆丁＞粗提液＞純化液。粗提液清除·DPPH能力比純化液高，原因可能是粗提液成分復雜，除黃酮外，還有多糖等具有抗氧化性物質(zhì)，而經(jīng)樹脂富集后，除去了部分抗氧化物質(zhì)，造成其清除能力下降。

2.6.2 純化物與VC、蘆丁復合抗氧化作用的相互關(guān)系

2.6.2.1 純化物與VC、蘆丁復配清除·DPPH的能力 根據(jù)“1.3.6.2”項方法，計算得出VC與純化物的IC50比值為1∶5.86；蘆丁與純化物的IC50比值為1∶1.52。選擇3組固定比例，VC與純化物的固定比例為1∶1、1∶6、1∶36，蘆丁與純化物的固定比例為1∶1、1∶2、1∶4。按固定該比例混合后，以 “1.3.6.1”項方法測定復配組清除·DPPH的能力，結(jié)果見表2。

表2 純化物與VC、蘆丁復配清除·DPPH的能力（n=3）

由表2可知，在測定范圍內(nèi)，VC與純化物各比例復配組的清除率均隨樣品質(zhì)量濃度的增大而先上升，然后趨于平緩。而蘆丁與純化物各比例中的清除率隨樣品質(zhì)量濃度的增大而上升，在測定范圍內(nèi)未出現(xiàn)平衡效應點。

根據(jù)表2計算純化物與VC和蘆丁復配清除·DPPH的IC50值，結(jié)果見表3。

表3 純化物與VC、蘆丁復配清除·DPPH的IC50值

由表3可知，VC與樣品復配后的抗氧化能力均強于單一樣品，但弱于VC；蘆丁與樣品復配后的抗氧化能力均強于單一樣品，與蘆丁相當。以上結(jié)果說明，樣品與VC和蘆丁均具有協(xié)同抗氧化作用。

2.6.2.2 純化物與VC、蘆丁復配的Isobologram分析圖

將表3所得純化物的IC50值及95%可信線標繪制在Isobologram分析圖的縱坐標上，VC和蘆丁的IC50值及95%可信線標繪在橫坐標上，再將兩者IC50值相連，構(gòu)成相加線，并作出95%置信區(qū)，再將復配組IC50值標在圖中。若復配組IC50值落在相加線上或95%置信區(qū)內(nèi)，則表示兩藥之間有相加作用；落在相加線左側(cè)，有協(xié)同作用；落在右側(cè)，有拮抗作用［16-20］。結(jié)果見圖6。

圖6 純化物與VC、蘆丁復配的Isobologram分析圖

由圖6可知，各復配組IC50的效應點均落在相加線左側(cè)，說明純化物與VC和蘆丁之間均有協(xié)同抗氧化作用。表2發(fā)現(xiàn)，VC（或蘆?。┡c純化物復配比例不同，所得復配液IC50值也不同，即清除·DPPH能力不同。VC與純化物復配的協(xié)同抗氧化能力依次為1∶1＞1∶6＞1∶36；蘆丁與純化物復配的協(xié)同抗氧化能力依次為1∶2＞1∶4＞1∶1。當VC和蘆丁與純化物復配比例為1∶1，清除率為50%時，與VC復配所需純化物質(zhì)量濃度為6.605μg/mL，而與蘆丁復配時該質(zhì)量濃度為16.55μg/mL，兩者相差較大，其原因可能是次抗氧化劑可以再生具有強抗氧化性能的主抗氧化劑［21］。由于VC的抗氧化作用比純化物強，故VC為主抗氧化劑，純化物為次抗氧化劑，VC清除·DPPH后轉(zhuǎn)化為氧化態(tài)的VC·，然后又與純化物作用產(chǎn)生VC，繼續(xù)清除·DPPH，直至完全清除。而且VC清除·DPPH能力較強，所需濃度低，因而使其再生所需純化物的濃度也低，其原理如下。

·DPPH + VC → DPPH + VC·

VC· +黃酮（還原態(tài)）→VC + 黃酮（氧化態(tài)）

3 結(jié)論

用NKA-Ⅱ大孔吸附樹脂對黑柴胡黃酮進行純化，最佳條件為pH 2，質(zhì)量濃度為0.608 4 mg/m L的黃酮液上柱，60%乙醇70 m L可將黃酮完全洗脫。該樹脂的富集倍數(shù)達5.05倍，說明它是純化黑柴胡黃酮的較理想樹脂。

·DPPH清除實驗比較了黑柴胡黃酮純化前后的抗氧化活性，并通過Isobologram分析圖對純化物與VC和蘆丁復配清除·DPPH的相互關(guān)系進行評價。結(jié)果表明，純化物對·DPPH清除能力弱于VC、蘆丁和粗提液，它與VC和蘆丁復配后具有協(xié)同抗氧化作用。不同比例的復配液，協(xié)同抗氧化能力有所差異，在本實驗中，VC與樣品黃酮最佳配比為1∶1，而蘆丁與樣品黃酮最佳配比為1∶2。

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R284.2

：B

：1001-1528（2015）06-1370-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.050

2014-03-28

甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室面上項目 （XZ1008）

李 帥（1992—），男，助教，研究方向為天然產(chǎn)物活性成分純化及分析。Email：JasonandJarry@163.com

*通信作者：吳冬青 （1961—），女，教授，研究方向為天然產(chǎn)物活性成分提取、純化及分析。Tel：13830691604，E-mail：hxuwdq@ 163.com