彭 靜， 陳志良*， 梁 磊， 鄧虹珠， 易延逵

（1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510515；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣東 廣州 510010；3.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州510515）

正交試驗(yàn)優(yōu)選易寧更年顆粒水提工藝及藥效學(xué)對(duì)比

彭 靜1， 陳志良1*， 梁 磊2*， 鄧虹珠3， 易延逵3

（1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510515；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣東 廣州 510010；3.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州510515）

目的優(yōu)選易寧更年顆粒水提取工藝。方法HPLC法測(cè)定特女貞苷，以特女貞苷量和浸膏得率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)選藥材浸泡時(shí)間、加水量與提取時(shí)間；采用免疫低下小鼠碳粒廓清功能作為工藝改變的藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)，將優(yōu)選工藝與原工藝進(jìn)行比較。結(jié)果正交設(shè)計(jì)水提取優(yōu)化結(jié)果為浸泡0.5 h，第1次加水量為10倍量，提取2 h，第2次加水為8倍量，提取1 h。原工藝與現(xiàn)工藝對(duì)免疫低下小鼠碳粒吞噬指數(shù)K和校正吞噬指數(shù)a均有提高，且優(yōu)選工藝對(duì)碳粒廓清功能增強(qiáng)更顯著 （P＜0.05）。結(jié)論該工藝簡(jiǎn)單、易行，能夠有效地提取女貞子中的特女貞苷，較原工藝能夠更加有效地提高免疫低下小鼠碳粒廓清功能。

女貞子；特女貞苷；易寧更年顆粒；正交試驗(yàn)；高效液相色譜法；碳粒廓清

易寧更年顆粒由女貞子、墨旱蓮、當(dāng)歸等多味藥材組成的中藥復(fù)方制劑，突出顯示滋陰補(bǔ)腎、行氣開郁等功效，能有效地調(diào)節(jié)女性圍絕經(jīng)期的諸多癥狀。作為醫(yī)院制劑長(zhǎng)期用于女性更年期癥狀，尤其在增強(qiáng)免疫功能相關(guān)癥狀時(shí)療效顯著。女貞子作為該方中君藥，具有調(diào)節(jié)免疫力、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、降血脂等廣泛的藥理作用［1-3］。已有化學(xué)研究表明，女貞子主要含有三萜類的脂溶性成分，對(duì)羥基苯乙醇苷類和裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類等水溶性成分［4］，以及多糖、揮發(fā)油、微量元素等多種化學(xué)成分。其中水溶性成分特女貞苷是女貞子的主要有效成分之一［5］。根據(jù)現(xiàn)行的 《中國(guó)藥典》2010年版，以特女貞苷作為女貞子藥材的質(zhì)量控制方法。本實(shí)驗(yàn)采用正交優(yōu)化設(shè)計(jì)，以藥材浸膏得率以及特女貞苷的量為考察指標(biāo)，篩選最優(yōu)工藝；并結(jié)合對(duì)免疫低下小鼠碳粒廓清功能的影響作為工藝改進(jìn)藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)估，為本制劑的提取工藝提供一個(gè)科學(xué)的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Aglient1100高效液相色譜儀；電子天平（德國(guó)sartrius BP110S）；超聲清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；十萬分之一天平 （Sartorius）；微量進(jìn)樣器 （Eppendorf公司）；多功能酶標(biāo)儀M5（美國(guó)MDS公司）。

1.2 試藥 易寧更年顆粒 （自制），貞芪扶正顆粒 （上海靜安制藥有限公司，批號(hào)140208-2），特女貞苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111926-201203），女貞子和墨旱蓮藥材 （廣州康圣藥業(yè)有限公司），無水Na2CO3（廣東光華化學(xué)有限公司），印度墨汁和環(huán)磷酰胺 （廣州市齊云生物技術(shù)有限公司），甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明 （KM）小鼠60只，雌性，體質(zhì)量18～22 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 （合格證號(hào)：SCXK［粵］2011-0015），實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物先適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

2 方法與結(jié)果

2.1 特女貞苷測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Thermo scientific色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），以甲醇-水 （35∶65）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為224 nm，體積流量為1 mL/min，柱溫為30℃。對(duì)照品進(jìn)樣量為5μL，供試品為10μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=175.1X+ 26.29（r=0.999 5），表明特女貞苷在0.202 3～3.034 5μg具有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在五氧化二磷干燥器中減壓干燥24 h的特女貞苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每1 m L含0.203 2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取女貞子和墨旱蓮適量，按照提取次數(shù)試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)提取，將提取液濃縮至一定體積后，按照提取次數(shù)試驗(yàn)進(jìn)行的濃縮液5 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容；而正交試驗(yàn)的濃縮液取1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液得到供試品溶液。

2.1.4 樣品測(cè)定 精密吸取供試品濃縮液適量注入高效液相色譜儀，按照文獻(xiàn)［6］測(cè)定，計(jì)算各樣品中特女貞苷的量。

2.1.5 浸膏得率測(cè)定 根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，精密吸取已定容的各供試品濃縮液過濾后取25mL，水浴蒸干，105℃干燥3 h，放冷至室溫稱定質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率。

2.2 女貞子水提工藝考察

2.2.1 將女貞子打碎的粗粉與未打碎的果實(shí)分別與墨旱蓮適量進(jìn)行水提，對(duì)女貞子是否打碎進(jìn)行考察，試驗(yàn)過程加10倍量水，提取4 h，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，按照 “2.1.3”項(xiàng)下提取次數(shù)的制備方法制備供試品溶液，用于特女貞苷提取率測(cè)定，根據(jù) “2.1.5”項(xiàng)下方法處理得到浸膏得率，試驗(yàn)安排和結(jié)果見表1。

從表1結(jié)果得出，打碎的女貞子浸膏得率和特女貞苷含有量均比未打碎的高，且打碎后的女貞子特女貞苷含有量明顯提高，因此在后續(xù)的試驗(yàn)中考慮將女貞子打碎后進(jìn)行提取。

2.2.2 提取次數(shù)考察 稱取女貞子和墨旱蓮適量，將女貞子打碎，加10倍量水提取3次，每次1.5 h，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，按照 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，用于測(cè)定浸膏得率、特女貞苷提取率，結(jié)果見表2。

表1 打碎和未打碎女貞子對(duì)易寧更年顆粒提取工藝的影響

表2 提取次數(shù)選擇試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表2結(jié)果分析得出：第2、3次浸膏得率和特女貞苷含有量與第1次差異明顯，第3次提取浸膏得率占總浸膏得率的比例較小，特女貞苷提取量占特女貞苷提取總量的比例小于10.0%，說明提取2次已基本提取完全，故提取次數(shù)定為2次。

2.2.3 水提條件優(yōu)選 以浸膏得率、特女貞苷提取量為考查指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對(duì)水提條件進(jìn)行優(yōu)選，根據(jù)特女貞苷的理化性質(zhì)，設(shè)計(jì)因素水平表，見表3。

表3 正交設(shè)計(jì)因素水平

依表，用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，按處方稱取女貞子和旱蓮草各50 g平行9份，女貞子打碎，加水提取，過濾，合并濾液，定容至一定體積。分別測(cè)定浸膏得率、特女貞苷含有量，并進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)分。評(píng)分時(shí)以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，再根據(jù)各指標(biāo)成分在工藝選擇中的主次地位，給以不同的加權(quán)系數(shù)。有效成分特女貞苷含有量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)權(quán)重為0.7，浸膏得率為次要評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)權(quán)重為0.3。即綜合評(píng)分：100%。結(jié)果見表4和5，數(shù)據(jù)按照文獻(xiàn)［8］用SPSS13.0處理得到。

以特女貞苷含有量和浸膏得率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行考察，從以上表格直觀分析得出，影響特女貞苷水提取效果的因素主次順序?yàn)椋篊＞B＞A，最佳提取工藝為A2B2C2。方差分析結(jié)果顯示A，B，C三個(gè)因素中均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，得到最佳提取工藝為藥材加水浸泡0.5 h，第1次加水10倍量提取2 h，第2次加水8倍量提取1 h。

表4 正交試驗(yàn)及結(jié)果

表5 綜合評(píng)分方差分析結(jié)果

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 因本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的工藝并未包括在9次正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中，故進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。稱取女貞子和墨旱蓮各50 g，共3份，按照優(yōu)選工藝A2B2C2進(jìn)行提取，按照“2.1.3”項(xiàng)正交試驗(yàn)制備方法制備供試品溶液，結(jié)果3次提取工藝的浸膏得率分別為25.17%、25.60%、25.46%，RSD為1.0%，特女貞苷提取量為24.12、24.89、24.59 mg/g藥材，RSD為1.6%，說明工藝基本可行。

2.4 藥效學(xué)試驗(yàn)

2.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模和分組 環(huán)磷酰胺模型組第1、2、3天皮下注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，隔1周后強(qiáng)化注射1次進(jìn)行造模。將60只小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只?？瞻讓?duì)照組 （生理鹽水）、環(huán)磷酰胺模型組 （生理鹽水）、易寧更年顆粒組 （3.3 g/kg，相當(dāng)于臨床用量20倍）、原工藝組（含生藥材6.4 g/kg，相當(dāng)于臨床用量20倍）、貞芪扶正顆粒組 （3.3 g/kg，相當(dāng)于臨床用量20倍）。各組按照20 mL/kg體質(zhì)量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)15 d。

2.4.2 碳粒廓清功能實(shí)驗(yàn)［9］于末次給藥1 h后，將稀釋3.5倍的印度墨汁按10 mL/kg劑量給予小鼠尾靜脈注射后，分別于2 m in、10 min內(nèi)眥采血，取20μL血液立即加入含有0.1%Na2CO32m L的EP管中，搖勻，于600 nm處測(cè)定吸光度 （OD）值。取血后小鼠采用頸椎脫臼法處死，取肝臟、脾臟稱定質(zhì)量。計(jì)算各組小鼠一定時(shí)間內(nèi)血液中碳粒吞噬指數(shù)K及校正吞噬指數(shù)α，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊，采用LSD法，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表6。

表6 兩種不同工藝對(duì)免疫低下小鼠碳粒廓清功能的影響

結(jié)果表明優(yōu)選的易寧更年顆粒較原工藝比較具有顯著性差異和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

目前，關(guān)于女貞子低極性的有效成分齊墩果酸的提取工藝和藥理作用研究較多［10-11］，并在2010年版 《中國(guó)藥典》以特女貞苷為標(biāo)準(zhǔn)前，是以齊墩果酸量為控制指標(biāo)。近幾年隨著女貞子化學(xué)成分的深入研究，關(guān)于其水溶性成分作為藥效成分研究越來越多［12-14］。由于中藥復(fù)方大部分是以水煎液為主，本研究采用操作簡(jiǎn)單、成本較低的水提取方法。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)［15］以及現(xiàn)行的 《中國(guó)藥典》2010年版，以女貞子藥材中水溶性成分特女貞苷含有量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合藥材浸膏得率綜合考察、設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)的提取工藝。以制劑中特女貞苷的含有量和浸膏得率優(yōu)選工藝，得到優(yōu)選工藝的特女貞苷含有量和浸膏得率較原工藝均有所提高 （P＜0.05）。

藥效試驗(yàn)碳粒廓清功能屬于非特異性免疫，是免疫應(yīng)答的一個(gè)重要方面。碳粒廓清指數(shù)K的大小反映注入血液中惰性碳粒的吞噬廓清能力和速度，而吞噬指數(shù)α則是排除體質(zhì)量、肝臟和脾臟的影響校正后的評(píng)價(jià)指標(biāo)，更加科學(xué)、準(zhǔn)確。中藥復(fù)方是一個(gè)多靶點(diǎn)、多效應(yīng)、發(fā)揮綜合作用的制劑，而本研究基于該制劑臨床作用在免疫方面療效顯著的特點(diǎn)以及各藥材的藥理作用，甄選碳粒廓清功能藥效學(xué)指標(biāo)進(jìn)行前后工藝的比較與驗(yàn)證，結(jié)果得出：優(yōu)選工藝比原工藝的碳粒廓清功能有所提高，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)前后工藝的質(zhì)量控制和藥效試驗(yàn)二者作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，不僅保證了有效成分的提取率，又對(duì)中藥復(fù)方的綜合藥效提供了科學(xué)的根據(jù)。

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R284.1

：B

：1001-1528（2015）06-1350-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.044

2014-08-18

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金 （81001701）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目珠江科技新星專項(xiàng) （2013J2200030）

彭 靜（1988—），女（土家族），碩士，從事藥劑學(xué)研究。Tel：15625063751，E-mail：pengjinghj@126.com

*通信作者：陳志良 （1950—），男，博士生導(dǎo)師，教授，從事新藥設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)。Tel：（020）61648263梁 磊 （1978—），女，博士，主管藥師，從事中藥藥理研究。Tel：（020）36652218