王 洋， 李樂(lè)樂(lè)， 李 波， 郭云龍， 劉淑瑩，2*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春130117；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林長(zhǎng)春130022）

DART-Orbitrap質(zhì)譜法快速定性定量分析延胡索

王 洋1， 李樂(lè)樂(lè)1， 李 波1， 郭云龍1， 劉淑瑩1，2*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春130117；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林長(zhǎng)春130022）

目的建立一種對(duì)延胡索進(jìn)行快速簡(jiǎn)便的定性鑒別和定量檢測(cè)方法。方法采用DART-Orbitrap質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)延胡索中的化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)照品比對(duì)和二級(jí)質(zhì)譜確證，采用Full MS-SIM/Targeted-MS2掃描方式采集信號(hào)，并對(duì)延胡索乙素母離子和子離子的提取離子流圖積分。結(jié)果在延胡索中檢測(cè)出延胡索甲素和乙素的質(zhì)子化離子峰，m/z分別為356.18和370.20，定量方法具有良好精密度和穩(wěn)定性，延胡索乙素的線(xiàn)性范圍為0.106～0.848μg/mL，r=0.997 0，平均加樣回收率114.1%。結(jié)論該方法定量分析時(shí)快速精確，并且定性鑒別時(shí)無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

：實(shí)時(shí)直接分析（DART）；Orbitrap質(zhì)譜；延胡索；定性定量分析

實(shí)時(shí)直接分析（direct analysis in real time，DART）離子源是一種新型的敞開(kāi)式大氣壓電離技術(shù)，在2005年由 Cody等［1］首次提出，同年由JOEL和IonSense公司將其商業(yè)化。這種電離技術(shù)不需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，能在幾秒鐘時(shí)間內(nèi)分析存在于氣體、液體、固體或材料表面的化合物，對(duì)樣品消耗量較低，而且分析過(guò)程中不需要引入大量的有機(jī)溶劑。DART可以與多種質(zhì)譜儀相聯(lián)，如飛行時(shí)間質(zhì)譜［2-3］、四級(jí)桿質(zhì)譜［4］、離子阱質(zhì)譜［5］等，可應(yīng)用于食品安全［6-7］、 爆炸物檢測(cè)［8］、藥品非法添加等方面［9-10］，但是在中藥材快速定性和定量方面的應(yīng)用相對(duì)較少［11-13］。

傳統(tǒng)中藥材鑒定方法包括基源鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定四大類(lèi)，各種方法都有其特點(diǎn)和適用對(duì)象，有時(shí)候還需要幾種方法配合才能完成對(duì)一種中藥材的準(zhǔn)確鑒定。在 《中國(guó)藥典》中關(guān)于中藥材的鑒別項(xiàng)下，常用的鑒別方法是薄層色譜法，該方法操作繁瑣，浪費(fèi)時(shí)間，過(guò)程中需要大量有機(jī)溶劑，污染環(huán)境。因此非常有必要建立一種原位、快速、綠色的鑒定中藥的方法。

本研究以延胡索藥材為代表，利用DART-Orbitrap質(zhì)譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種原位、簡(jiǎn)便、快速、綠色的中藥材定性定量的方法。

1 儀器與材料

DART離子源 （包括自動(dòng)滑軌、載樣熔點(diǎn)管、十孔載樣器、載樣篩網(wǎng)，美國(guó)Ion Sense公司）；QExactive Orbitrap質(zhì)譜儀（Xcaliber工作站，美國(guó)賽默飛世爾公司）。甲醇 （色譜純，美國(guó)TEDIA公司）；高純氮?dú)?、氦?（純度＞99.999%，長(zhǎng)春巨洋氧氣廠）；延胡索乙素 （北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號(hào)130828）；延胡索藥材由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法與參數(shù)

2.1 檢測(cè)條件

2.1.1 DART條件 離子化氣體為氦氣；待機(jī)氣體為氮?dú)?；氣體壓力為0.5 MPa；氣體溫度為300℃；其他參數(shù)采用儀器默認(rèn)設(shè)置；采用篩網(wǎng)進(jìn)樣方式；載樣器滑動(dòng)速度為0.2 mm/s；正離子模式采集。

2.1.2 Orbitrap質(zhì)譜條件 掃描范圍m/z50～750；分辨率為35 000；AGC target 1×10-6；正離子模式；掃描方式為Full MS-SIM/Targeted-MS2；碎裂電壓NCE為35；DART離子源與質(zhì)譜儀入口之間的距離為1 cm。

2.2 樣品制備 精密配制1 mg/mL的延胡索乙素對(duì)照品溶液，作為貯備液。精密稱(chēng)取延胡索粉末2 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲提取10 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足至刻度線(xiàn)，混勻，離心（12 000 r/min，10 min），取上清液作為供試品，即得。用熔點(diǎn)管蘸取樣品溶液置于氦氣流中檢測(cè)，或者用移液槍吸取樣品點(diǎn)在載樣篩網(wǎng)上，每次檢測(cè)時(shí)間為6 s，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

3 結(jié)果和討論

3.1 氦氣溫度的選擇 DART離子源工作氣體和溫度是影響離子化效果和信號(hào)強(qiáng)弱的主要因素，也是DART方法開(kāi)發(fā)時(shí)應(yīng)該重點(diǎn)考慮的參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)選取了DART研究中最常用的兩種氣體氮?dú)夂秃夥謩e進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高純氦氣作為工作氣體時(shí)，離子峰的強(qiáng)度和檢測(cè)限明顯優(yōu)于氮?dú)?，這與文獻(xiàn)［11］報(bào)道一致，所以選擇高純氦氣作為DART的工作氣體。

同時(shí)，我們也對(duì)工作氣體的溫度進(jìn)行了優(yōu)化，選用 《中國(guó)藥典》規(guī)定的延胡索乙素為指標(biāo)，結(jié)果如圖1（A）所示。溫度從50℃升高到450℃，溫度間隔為50℃，在100℃下可以觀測(cè)到質(zhì)子化的延胡索乙素m/z356.18［M+H］+，但是背景干擾較大，信噪比較低。隨著溫度升高，m/z356.18的強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)溫度到達(dá)300℃時(shí)，強(qiáng)度趨于平穩(wěn)，至450℃時(shí)保持恒定。有文獻(xiàn)［11］報(bào)道，高溫可能導(dǎo)致樣品分解或焦化，因此本實(shí)驗(yàn)選擇300℃作為檢測(cè)的溫度。

圖1 延胡索乙素離子強(qiáng)度隨溫度的變化曲線(xiàn)（A）和其在300℃時(shí)的DART-M S譜圖（B）Fig.1 Signal intensity of tetrahydropalmatine ion on different helium gas tem peratures（A）and DART mass spectrum of tetrahydropalmatine at 300℃（B）

3.2 掃描方式的選擇 本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了Full MSSIM/Targeted-SIM和Full MS-SIM/Targeted-MS2兩種掃描方式。在Full MS-SIM/Targeted-SIM中，利用質(zhì)子化延胡索乙素的精確相對(duì)分子質(zhì)量，對(duì)總離子流圖進(jìn)行提取，并對(duì)其峰面積積分；在Full MSSIM/Targeted-MS2中，對(duì)m/z 356.18進(jìn)行串聯(lián)（圖2A），得到m/z192.10碎片離子，在定量時(shí)選擇m/z356.18和m/z192.10對(duì)總離子流圖進(jìn)行提取，并對(duì)提取離子流圖的峰面積進(jìn)行積分。以上兩種掃描方式，在對(duì)延胡索對(duì)照品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)差別不大，但是對(duì)延胡索藥材檢測(cè)時(shí)，由于藥材中成分較多，會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成一定干擾，因此本實(shí)驗(yàn)選擇Full MS-SIM/Targeted-MS2掃描方式，以提高定量的準(zhǔn)確度。

3.3 定性檢測(cè) 熔點(diǎn)管蘸取延胡索提取液置于氦氣流中，用DART-Orbitrap MS采集信號(hào)，結(jié)果如圖3A所示。在質(zhì)譜圖中，可以看到有質(zhì)子化的延胡索乙素峰 （m/z 356.181 0），另外還檢測(cè)到了m/z370.159 3、m/z384.176 2、m/z322.103 1和m/z342.165 4。通過(guò)對(duì)比精確相對(duì)分子質(zhì)量，確定m/z370.159 3為延胡索甲素，我們對(duì)m/z 356和m/z 370進(jìn)行碎裂，碎裂機(jī)理如圖3所示。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還對(duì)延胡索藥材進(jìn)行直接檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3B所示。得到的質(zhì)譜圖與延胡索提取液譜圖一樣，盡管背景干擾較大，信號(hào)強(qiáng)度較低，但是對(duì)于藥材的定性鑒別來(lái)說(shuō)影響不大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，DART-MS技術(shù)可以用來(lái)對(duì)延胡索進(jìn)行定性檢測(cè)，與傳統(tǒng)的薄層色譜方法相比，具有速度快、節(jié)省有機(jī)溶劑、無(wú)需樣品前處理等優(yōu)點(diǎn)，另外多個(gè)指標(biāo)同時(shí)定性還提高了結(jié)果的可信度。

圖2 延胡索乙素 （A）和延胡索甲素 （B）的串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.2 DART tandem m ass spectra of tetrahydropalm atine（A）and corydaline（B）

圖3 延胡索提取液（A）和延胡索藥材（B）的DART-MS譜圖Fig.3 DARTmass spectra of extracting solution of Corydalis Rhizoma（A）and Corydalis Rhizoma medicinalmaterial（B）

3.4 定量檢測(cè) 依據(jù) 《中國(guó)藥典》中對(duì)延胡索藥材的規(guī)定，本實(shí)驗(yàn)選取延胡索乙素作為定量檢測(cè)的指標(biāo)。同時(shí)，對(duì)載樣方式進(jìn)行優(yōu)化。由于熔點(diǎn)管進(jìn)樣無(wú)法準(zhǔn)確控制載樣量，而篩網(wǎng)進(jìn)樣可以用移液槍進(jìn)行控制，所以實(shí)驗(yàn)中選擇篩網(wǎng)作為載樣的方式。另外，對(duì)滑軌滑動(dòng)速度進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)如果以較快的速度進(jìn)行滑動(dòng)，篩網(wǎng)上的樣品無(wú)法被完全離子化，影響方法的線(xiàn)性關(guān)系。通過(guò)對(duì)比，確定滑軌滑動(dòng)的速度為0.2 mm/s。測(cè)定發(fā)現(xiàn)，該方法對(duì)延胡索乙素的檢測(cè)限為10.6 ng。

3.4.1 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為0.106μg/m L的對(duì)照品溶液5μL，點(diǎn)樣至篩網(wǎng)上，按 “2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定6次，以延胡索乙素提取離子流圖的峰面積計(jì)算。結(jié)果，RSD為4.3%，表明儀器的精密度良好。

3.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次延胡索藥材，按照 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，分別取5μL，點(diǎn)樣至篩網(wǎng)上，按 “2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)，以延胡索乙素提取離子流圖的峰面積計(jì)算。結(jié)果，RSD為 5.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.4.3 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品貯備液適量，分別配制成質(zhì)量濃度為 0.106、0.212、0.318、0.424、0.530、 0.636、0.742、 0.848 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別吸取上述對(duì)照品1μL，點(diǎn)樣至篩網(wǎng)上，載樣器滑動(dòng)速度為0.2 mm/s，進(jìn)行檢測(cè)。以峰面積 （Y）和對(duì)照品質(zhì)量濃度 （X）進(jìn)行回歸分析，得到延胡索乙素的回歸方程為Y= 7.16×106X-2.43×108，r=0.997 0。結(jié)果表明，延胡索乙素在0.106～0.848μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

3.4.4 回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定含有量的同一批次延胡索藥材，按照 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別吸取10μL供試品溶液5份，點(diǎn)樣至載樣篩網(wǎng)上，溶劑揮干后，再分別吸取0.106μg/m L的對(duì)照品溶液2μL點(diǎn)樣于載樣篩網(wǎng)上，將篩網(wǎng)置于滑軌上，測(cè)定延胡索乙素的量。結(jié)果，計(jì)算其回收率分別為119.0%、102.8%、99.1%、123.1%和126.7%，加樣回收率的范圍在99.1%～126.3%之間，平均加樣回收率為114.1%。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種快速定性定量分析的方法，采用DART離子源結(jié)合高分辨Orbitrap質(zhì)譜對(duì)延胡索進(jìn)行檢測(cè)，完成一次檢測(cè)僅需要6 s。在定性鑒別時(shí)，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，直接將藥材置于電離區(qū)，通過(guò)質(zhì)譜信號(hào)的精確相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行定性鑒別。相比于常用的薄層色譜法，該方法具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快、不需要引入有機(jī)試劑等特點(diǎn)，另外多種成分的同時(shí)定性提高了鑒別的準(zhǔn)確性。在定量分析的準(zhǔn)確度和重復(fù)性上，該方法相比于傳統(tǒng)的色譜方法稍顯遜色，但是其所具有的實(shí)時(shí)、快速、綠色和無(wú)需或者只需很小的樣品前處理等優(yōu)點(diǎn)，將在中藥材或中成藥的高通量篩查、快速定性鑒別、快速定量以及質(zhì)量控制上顯示出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。若能與小型便攜式質(zhì)譜結(jié)合，它定能更好地發(fā)揮其原位檢測(cè)、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和實(shí)時(shí)分析的優(yōu)點(diǎn)。

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Rapid qualitative and quantitative analysis of Corydalis yanhusuo by DART-Orbitrap mass spectrometry

WANG Yang1， LILe-le1， LIBo1， GUO Yun-long1， LIU Shu-ying1，2*
（1.Jilin Ginseng Academy，Changchun University of ChineseMedicine，Changchun 130117，China；2.Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Changchun 130022，China）

AIMTo establish a rapid and simple method for qualitative and quantitative analysis of Corydalis Rhizoma.M ETHODSDART-Orbitrap mass spectrometry was used to analyze the sample as compared withstandard sample.And the full scan spectra and secondary spectra were also adopted for the component identification.The fullMS-SIM/Targeted-MS2mode was applied to determining themass spectrum.Extract ion chromatography was used for quantitative analysis.RESULTSThe protonated molecule ion of corydaline and tetrahydropalmatine were observed in Corydalis Rhizoma based on the m/z356.18 and 370.20.The quantitative analysis demonstrated with good reproducibility，the linear of tetrahydropalmatine was in the range of 0.106-0.848μg/mL（r=0.9970），and the average recovery rate was 114.1%.CONCLUSIONThemethod is rapid and accuracy in the quantitative analysis，and does not need the pretreatment of samples in the qualitative analysis.

directanalysis in real time（DART）；Orbitrap mass spectrometry；Corydalis Rhizoma；qualitative and quantitative analysis

R284.1

：A

：1001-1528（2015）06-1279-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.026

2014-08-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （21175127）

王 洋 （1986—），男，碩士，實(shí)習(xí)研究員，從事中藥化學(xué)和代謝組學(xué)研究。Tel：（0431）86045256，E-mail：white-wing@ 163.com

*通信作者：劉淑瑩（1943—），女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，從事質(zhì)譜分析研究。E-mail：syliu@ciac.ac.cn