金姍姍， 鄭雅文， 張 潔， 齊 銳， 劉 斌， 李志革

（蘭州大學口腔醫(yī)學院，甘肅蘭州730000）

三種口腔潰瘍中藥制劑對小鼠成纖維細胞生長增殖和膠原合成的影響

金姍姍， 鄭雅文， 張 潔， 齊 銳， 劉 斌， 李志革*

（蘭州大學口腔醫(yī)學院，甘肅蘭州730000）

目的探討3種治療復發(fā)性口腔潰瘍中藥制劑 （西瓜霜、云南白藥、甘草瀉心湯）在細胞水平上促進潰瘍愈合的作用機制。方法建立小鼠口腔成纖維細胞體外培養(yǎng)模型，以華素片為對照，采用MTT、Elisa測定3種中藥制劑對成纖維細胞增殖、膠原合成的影響。結果西瓜霜在促進成纖維細胞的增殖及膠原合成，抑制MMP-2，促進TIMP-1方面有較顯著的作用。云南白藥促進能夠HYP的分泌和抑制MMP-2的分泌。甘草瀉心湯對成纖維細胞有一定的抑制作用。結論提示臨床上治療復發(fā)性口腔潰瘍時應聯(lián)合用藥或分期用藥。

復發(fā)性口腔潰瘍；西瓜霜；云南白藥；甘草瀉心湯；小鼠成纖維細胞L929；膠原合成；羥脯氨酸 （HYP）；金屬基質蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）

復發(fā)性口腔潰瘍（recurrent oral ulcer）是常見的口腔疾病之一，發(fā)病率高達20%左右，為口腔黏膜發(fā)病首位［1］。復發(fā)性口腔潰瘍具有周期性、復發(fā)性和自限性等特征，潰瘍燒灼痛明顯，常給患者的生活和工作帶來不便［2］。復發(fā)性口腔潰瘍誘因復雜、機制不明，在臨床治療中以緩解疼痛、促進愈合為主，并無明確有效的治療方法。市面上治療復發(fā)性口腔潰瘍的藥物眾多，但藥物作用機制的研究比較欠缺，這造成醫(yī)生和患者在選擇藥物時具有盲目性和偶然性。成纖維細胞的增殖和膠原合成是復發(fā)性口腔潰瘍愈合的重要過程［3］。成纖維細胞分泌的金屬基質蛋白酶 （MMP）及其抑制劑（TIMP），共同參與和調控胞外基質的降解和重建［4］。

中草藥制劑現(xiàn)已成為治療復發(fā)性口腔潰瘍的常用藥物，主要以市售西瓜霜、云南白藥等為主［5］。目前本課題組在前期甘草瀉心湯研究與應用的基礎上，提出了甘草瀉心湯治療復發(fā)性口腔潰瘍的觀點，并取得了一定的臨床效果，但是這類藥物的治療機理，尤其是在潰瘍愈合方面的研究，目前未見相關報道。本實驗建立了體外小鼠口腔成纖維細胞L929培養(yǎng)模型，以西藥制劑華素片為對照，研究中藥制劑西瓜霜、云南白藥、甘草瀉心湯對小鼠口腔成纖維細胞增殖及對羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）金屬基質蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）金屬基質蛋白酶抑制因子-1（metal matrix protease inhibitor-1，TIMP-1）合成的影響，在細胞水平上揭示其在潰瘍愈合過程中的作用及機制，從而為臨床用藥提供一定的實驗和選擇依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株 小鼠口腔成纖維細胞系L929，購自中科院上海生化細胞所。

1.2 藥品及試劑 西瓜霜 （主要成分為西瓜霜、鍛硼砂、山豆根等），購自桂林三金藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號130214；云南白藥 （主要成分為三七、重樓、麝香），購自云南白藥集團股份有限公司產(chǎn)品，批號 ZDA1311；華素片 （主要成分碘），購自北京華素制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號1303142；甘草瀉心湯（甘草12 g，黃芩9 g，半夏12 g，大棗12枚，黃連3 g，干姜9 g，黨參9 g。購自惠仁堂藥店），自制。DMEM培養(yǎng)基、新生小牛血清，購自美國GIBCO公司；胰蛋白酶、四唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO），購自美國Sigma公司；HYP、MMP-2、TIMP-1測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 試驗藥液制備 將甘草瀉心湯草藥粉碎成極細粉過篩并混合均勻，置于200 mL超純水中，4℃24 h，12 000 r/min離心30 min，取上清液冷凍干燥，制得甘草瀉心湯水提物。分別稱取5 mg的西瓜霜、云南白藥、華素片、甘草瀉心湯溶于含10%胎牛血清和青、鏈霉素各100 IU/mL的10 mL DMEM培養(yǎng)基，用磁力攪拌器攪拌24 h后用氯氣滅菌，再倍比稀釋為125、62.5、31.25μg/mL的藥液備用。0.00μg/mL為陰性對照組。

2.2 細胞培養(yǎng)［6］小鼠口腔成纖維細胞系L929用含10%胎牛血清和青、鏈霉素各100 IU/m L的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2飽和濕度的恒溫孵育箱內培養(yǎng)2～3 d左右，當細胞密度達到70%～80%時傳代。將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液棄去，加0.25%胰酶消化2～3 min，倒置顯微鏡下觀察，當大多數(shù)細胞由長梭形變圓時，立即向培養(yǎng)瓶中加培養(yǎng)液約5 mL，并輕輕吹打瓶壁使細胞脫落，按1∶4比例傳代培養(yǎng)于75 mL培養(yǎng)瓶。

2.3 細胞接種［6］取對數(shù)生長期的 L929細胞，用0.25%胰酶充分消化成單細胞懸液。用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，調整細胞密度為2×104個/mL，接種到96孔板，每孔接種100μL，每孔設置6個重復孔。細胞貼壁24 h后，棄上清液，分別加入制備好的不同藥液100μL，繼續(xù)培養(yǎng)。陰性對照組為移去上清后，加入100μL含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。

2.4 MTT檢測［7］當細胞與藥液作用24 h、48 h、72 h后，收集上清液，加入不含血清的DEME培養(yǎng)基100μL，再每孔加入MTT（5 g/L）20μL。常規(guī)繼續(xù)孵育4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO（二甲基亞砜）150μL，在振蕩器上振蕩10 min，待紫色結晶完全溶解后，立即用酶聯(lián)免疫測定儀測定490 nm處的吸光度值 （OD值）。

2.5 HYP、MMP-2、TIMP-1測定 收集上清液，上清液中的HYP、MMP-2、TIMP-1水平分別采用小鼠HYP、MMP-2、TIMP-1 Elisa試劑盒進行測定。按試劑盒說明書進行操作，根據(jù)標準曲線計算出上清液中HYP、MMP-2、TIMP-1的水平。每一個樣品重復3次。

2.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，各項指標水平以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 3種中藥制劑對小鼠成纖維細胞L929增殖的影響 24 h時，西瓜霜 （圖1-A）各質量濃度組OD值波動較大，可能由于藥物的加入，成纖維細胞需要一定的適應時間；云南白藥 （圖1-B）各質量濃度組OD值與對照組差距無明顯意義。甘草瀉心湯 （圖1-C）與西瓜霜組變化相似。華素片 （圖1-D）各質量濃度組OD值與對照組差距無明顯意義。48 h時，西瓜霜、華素片在31.25μg/mL下可以以時間-質量濃度依賴性地促進成纖維細胞生長；甘草瀉心湯隨質量濃度增加OD值降低，抑制作用明顯。云南白藥各質量濃度組OD值與對照組差距無明顯意義。72 h時，西瓜霜、云南白藥、甘草瀉心湯、華素片在125μg/mL下培養(yǎng)72 h時對成纖維細胞有一定的抑制作用。見圖1。

圖1 不同藥物組對小鼠成纖維細胞L929增殖的影響Fig.1 Effect of different herbal preparations on the p roliferation of m ice fib roblasts L929

3.2 3種中藥制劑48 h時對小鼠成纖維細胞HYP水平的影響 結果如圖2所示，西瓜霜組、云南白藥組在31.25μg/m L時小鼠成纖維細胞的HYP水平顯著高于陰性對照組，隨藥物質量濃度增加，促進作用下降，無統(tǒng)計學意義。甘草瀉心湯組隨藥物質量濃度增加，促進作用增強，在125μg/mL時達到頂峰。華素片組在31.25μg/m L、125μg/m L時小鼠成纖維細胞的HYP水平顯著升高 （P＜0.05）。在該項指標檢測中，西瓜霜、云南白藥、華素片均在較低質量濃度就出現(xiàn)一定的促進作用。

3.3 3種中藥制劑48 h時對小鼠成纖維細胞MMP-2水平的影響 結果如圖3所示，4組藥物在31.25μg/mL水平下對小鼠成纖維細胞的MMP-2水平有抑制作用，但無統(tǒng)計學意義；在62.25 μg/mL水平下對小鼠成纖維細胞的MMP-2水平具有顯著性抑制作用；當質量濃度達到125μg/m L云南白藥、甘草瀉心湯、華素片組小鼠成纖維細胞的MMP-2值顯著仍低于陰性對照組。在該項指標檢測中，華素片隨質量濃度的增加抑制作用加強。

圖2 3種中藥制劑48 h時對小鼠成纖維細胞HYP水平的影響Fig.2 Effects of three herbal preparations on hydroxyproline level in m ice fibrob last in 48 h

3.4 3種中藥制劑48 h時對小鼠成纖維細胞TIMP-1水平的影響 結果圖4所示，西瓜霜、甘草瀉心湯對小鼠成纖維細胞的TIMP-1有明顯促進作用；而在62.25μg/mL下云南白藥和華素片具有抑制作用。

4 討論

圖3 3種中藥制劑48 h時對小鼠成纖維細胞MMP-2水平的影響Fig.3 E ffects of three herbal preparations on MMP-2 level in m ice fibroblast in 48 h

圖4 3種中藥制劑48 h時對小鼠成纖維細胞TIMP-1水平的影響Fig.4 Effects of three herbal preparations on TIMP-1 level in m ice fibroblast in 48 h

復發(fā)性口腔潰瘍是以疼痛和周期性復發(fā)為特點的口腔黏膜自限性潰瘍性損害，是口腔黏膜最常見的疾病之一。復發(fā)性口腔潰瘍誘因復雜、機制不清，目前臨床上治療的目的主要是緩解疼痛、促進愈合，而藥物治療機制的研究比較少見報道。傳統(tǒng)中藥制劑在臨床上有廣泛應用并取得了一定的治療效果，但其作用機制的研究較匱乏。本試驗建立小鼠口腔成纖維細胞體外培養(yǎng)模型，以西藥制劑華素片為對照，從細胞水平研究西瓜霜、云南白藥、甘草瀉心湯對成纖維細胞增殖及膠原合成的影響，揭示中藥制劑在潰瘍愈合過程中的作用機制。

復發(fā)性口腔潰瘍愈合的過程包括舊膠原的降解和新膠原的重排、沉積，參與此過程的主要細胞是成纖維細胞，其主要作用是參與形成肉芽組織、合成并分泌胞外基質、金屬基質蛋白酶 （MMPs）及其抑制因子（TIMPs）［8］。在IL-1、IL-4、PDGF、FGF、及TNF等刺激下，由間充質細胞分化而來的成纖維細胞合成和分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原。同時成纖維細胞合成和分泌MMPs及其TIMPs共同參與和調控了細胞外基質的降解，MMPs和TIMPs的相互作用及平衡是胞外基質重建的關鍵［9］。本實驗中西瓜霜和華素片可促進成纖維細胞的增殖，提示其促進潰瘍愈合的作用可能與促進成纖維細胞的增殖有關，而云南白藥對成纖維細胞的增殖無顯著作用，甘草瀉心湯對成纖維細胞的增殖具有抑制作用。

羥脯氨酸 （HYP）是膠原蛋白的主要組成成分，具有多種生理功能及獨特的生物活性，常作為各種軟組織疾病的藥物，如結締組織受損、風濕性關節(jié)炎等，同時具有加快傷口愈合的作用，可用于治療各種皮膚疾病［10-11］。李秋營等通過對成纖維細胞中HYP水平的測定，較好地反映了成纖維細胞活性、增殖及膠原合成等情況［12］。與對照組相比，在4種藥物作用下，上清液中的HYP水平明顯上升，說明4種藥物均可促進小鼠成纖維細胞分泌HYP，從而提示4種藥物在潰瘍愈合過程中可促進膠原的合成。

基質金屬蛋白酶（MMPs）是一組具有極大同源性的蛋白內肽酶的總稱，與胞外基質降解和結締組織修復緊密相關［13］?；|金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是MMPs的特異性抑制因子，以1∶1的比例與MMPs結合，抑制其活性［14］。MMPs與TIMPs的平衡的破壞會影響到正常組織的重塑和創(chuàng)傷的愈合，其與許多疾病的發(fā)生相關［15］。MMP-2、9在正常的口腔黏膜組織中呈弱陽性表達，在慢性潰瘍面中MMP-2、9表達與對照組有顯著差異，呈陽性表達，同時在慢性潰瘍面還存在TIMP-1的減少［16-17］。康媛媛的研究表明在病理條件下，MMP-2能降解黏膜組織中的Ⅳ膠原，表明其在人體黏膜組織的溶解破壞過程中有重要作用［18］。因此，可以推測口腔潰瘍過程中胞外基質及基底膜的破壞與MMP-2的表達水平有關。在潰瘍愈合初期，抑制成纖維細胞MMP-2的表達、促進TIMP-1的表達有利于潰瘍的愈合。本實驗結果顯示，與對照組相比，4種藥物都具有抑制成纖維細胞合成分泌MMP-2的作用，西瓜霜和甘草瀉心湯可促進TIMP-1的合成分泌，但云南白藥和華素片則對TIMP-1的合成分泌具有抑制作用。提示西瓜霜和甘草瀉心湯在潰瘍愈合的初期可抑制成纖維細胞MMP-2的表達和促進TIMP-1的表達，從而有利于潰瘍愈合初期的膠原合成與沉積。

綜上所述，西瓜霜在促進成纖維細胞的增殖及膠原合成，抑制MMP-2，促進TIMP-1方面有較顯著的作用。云南白藥對成纖維細胞的增殖無促進作用，但可促進HYP的分泌和抑制MMP-2的分泌，在潰瘍愈合的早期發(fā)揮重要的作用。甘草瀉心湯對成纖維細胞有一定的抑制作用，但可通過促進HYP、TIMP-1分泌，抑制MMP-2分泌，來促進潰瘍的愈合。3種治療復發(fā)性口腔潰瘍的中藥制劑對小鼠成纖維細胞增殖和膠原合成的作用機制不同，提示臨床上治療復發(fā)性口腔潰瘍時應聯(lián)合用藥或分期用藥，從而獲得更好的臨床治療效果，但要明確藥物對潰瘍愈合的具體作用機制，還需進一步的實驗探究。

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Effects of three herbal preparations for recurrent oral ulcer on proliferation and collagen synthesis of the fibroblasts in m ice

JIN Shan-shan， ZHENG Ya-wen， ZHANG Jie， QIRui， LIU Bin， LIZhi-ge*
（School of Stomatology，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

AIMTo study themechanisms of three kinds of herbal preparations（Watermelon Frost，Yunnan Baiyao，Gancao Xiexin Decoction）for recurrent oral ulcer on ulcer healing in cellular levels.METHODSMice fibroblast L929 was used as the in vitro model for recurrent oral ulcer；cydiodin was employed as the control drug. The effects of herbal preparations on the fibroblast proliferation and collagen production were determined by MTT assay and Elisa Kit，respectively.RESULTSWatermelon Frost promoted the fibroblast proliferation and collagen synthesis，inhibited MMP-2 level and increased TIMP-1 level；Yunnan Baiyao stimulated the secretion of HYP and down-regulated the secretion ofMMP-2 level；Gancao Xiexin Decoction inhibited the fibroblast.CONCLUSIONThe experimental data suggests that the clinical treatment for recurrent oral ulcer should be approached by combining these three preparations or applying them in different stages.

recurrent oral ulcer；Watermelon Frost；Yunnan Baiyao；Gancao Xiexin Decoction；mice fibroblast；collagen synthesis；hydroxyproline（HYP）；metalmatrix protease inhibitor-1（TIMP-1）

R285.5

：A

：1001-1528（2015）06-1176-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.005

2014-07-15

“本科教學工程”國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃 （201310730167）；甘肅省中醫(yī)藥科學技術研究課題 （GZK-2011-9）；甘肅省自然科學基金（1208RJYA011）

金姍姍（1992—），女，本科生。Tel：15214011979，E-mail：jinss1022@163.com

*通信作者：李志革 （1968—），男，教授，副主任醫(yī)師，研究方向為口腔頜面外科學。Tel：13993141029，E-mail：lizhg@lzu.edu.cn