宋厚盼， 謝夢(mèng)洲， 胡志希， 黃惠勇， 蔡 雄

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南長(zhǎng)沙410208）

白術(shù)、黃芪、黨參促進(jìn)IEC-6細(xì)胞損傷后的快速修復(fù)

宋厚盼， 謝夢(mèng)洲， 胡志希， 黃惠勇*， 蔡 雄*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，湖南長(zhǎng)沙410208）

目的研究白術(shù)、黃芪、黨參提取物對(duì)體外胃腸黏膜上皮細(xì)胞損傷的快速修復(fù)作用。方法采用Tips劃痕法建立小腸上皮 （IEC-6）細(xì)胞遷移模型，首先考察不同的IEC-6細(xì)胞接種密度、劃痕后修復(fù)時(shí)間、不同的血清濃度以建立穩(wěn)定的遷移模型；接著采用表皮生長(zhǎng)因子 （EGF）及其阻斷劑AG1478對(duì)遷移模型進(jìn)行評(píng)價(jià)；最后考察三味中藥對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移的作用效果。結(jié)果（1）細(xì)胞的最佳接種密度為1×105個(gè)/mL；（2）宜在劃痕后8 h計(jì)算細(xì)胞遷移率；（3）1%血清濃度為最適宜濃度；（4）EGF明顯促進(jìn)了IEC-6細(xì)胞遷移，AG1478明顯抑制了細(xì)胞遷移；（5）白術(shù)、黃芪、黨參提取物均可促進(jìn)IEC-6細(xì)胞遷移。結(jié)論益氣健脾中藥可促進(jìn)胃腸黏膜損傷后的快速修復(fù)過(guò)程，其機(jī)制是否與影響EGFR信號(hào)通路有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

胃腸黏膜損傷；IEC-6細(xì)胞；細(xì)胞遷移模型；表皮生長(zhǎng)因子 （EGF）；白術(shù)；黃芪；黨參

人體的胃腸黏膜表面上皮代表著胃腸道的一道重要屏障，它能阻止腸腔內(nèi)的許多毒性物質(zhì)和免疫原性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體。胃腸道表面屏障的損傷和破壞常見(jiàn)于各種不同的胃腸道疾病如慢性胃炎、炎癥性腸病等，并且有可能導(dǎo)致毒性和免疫原性物質(zhì)滲透和吸收的增加，從而使機(jī)體產(chǎn)生炎癥、不受控制的免疫反應(yīng)、以及宿主體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的失調(diào)等癥狀［1］。因此，黏膜損傷后的上皮表面屏障的快速修復(fù)過(guò)程對(duì)維持正常的穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。

胃腸道黏膜的損傷常來(lái)源于藥物、外力、應(yīng)激、酒精等因素的誘發(fā)，胃腸黏膜是人體更新最快的組織之一，通過(guò)上皮細(xì)胞的快速遷移，其在損傷后具有很強(qiáng)的快速修復(fù)能力。上皮表面連續(xù)性的重建主要依賴于受損表面附近的上皮細(xì)胞遷移至損傷區(qū)域并覆蓋裸露的部位，這個(gè)過(guò)程一般發(fā)生于損傷后的幾分鐘至幾個(gè)小時(shí)不等［2］。

腸上皮（IEC-6）細(xì)胞來(lái)源于正常大鼠小腸隱窩，它保持了腸上皮干細(xì)胞未分化的特性，現(xiàn)普遍將其作為體外模型用于研究人體胃腸黏膜損傷后修復(fù)過(guò)程。本課題組前期的研究曾采用手術(shù)刀片劃痕法考察黏膜損傷后的重建過(guò)程，但該方法操作繁瑣，容易產(chǎn)生人為的實(shí)驗(yàn)誤差。為改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，提高實(shí)驗(yàn)效率和實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，本研究采用Tips（槍頭）劃痕法建立IEC-6細(xì)胞損傷后的遷移模型，通過(guò)考察細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)時(shí)間、血清濃度確定該遷移模型，并以表皮生長(zhǎng)因子 （EGF）和表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）阻斷劑Tyrphostin AG 1478（AG1478）評(píng)價(jià)該模型的可靠性，最后采用白術(shù)提取物、黃芪提取物和黨參提取物進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

1.1 細(xì)胞株 IEC-6細(xì)胞（來(lái)源于正常大鼠小腸隱窩），購(gòu)自美國(guó)典型微生物菌種保藏中心（ATCC，編號(hào)C11995，批號(hào)8112123）。

1.2 藥材 白術(shù)、黃芪及黨參藥材均購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定，白術(shù)為菊科植物白術(shù)（Atractylodesmacrocephalae Rhizoma）的根莖，黃芪為豆科植物蒙古黃芪（Astragali Radix）的根，黨參為桔?？浦参稂h參（Codonopsis Radix）的根。

1.3 儀器 IX-71型熒光相差倒置顯微鏡（Olympus公司）；HW03017-VBA型CO2培養(yǎng)箱（HARRIS公司）；AUM-120D 島津分析天平（SHIMADZU公司）；高壓滅菌器（美國(guó)Zealway公司）；TGL-16B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.4 試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基 （批號(hào)8112123）、胎牛血清FBS（批號(hào)1027885）、Penicillin Streptomycin雙抗溶液（批號(hào)1116222），TrypLETMExpress試劑（批號(hào)1045845，美國(guó)Life technologies公司）；表皮生長(zhǎng)因子 （EGF，批號(hào)E9644）、選擇性表皮生長(zhǎng)因子受體阻斷劑Tyrphostin AG 1478（批號(hào)T4182，美國(guó)Sigma公司）。其他試劑均為分析純，碧云天生物技術(shù)研究所。

2 方法

2.1 白術(shù)、黃芪和黨參提取物的制備 精確稱量200 g白術(shù)藥材飲片，打粉后加入800 mL 90%的乙醇35℃超聲提取30 min（100W，40 kHz），重復(fù)提取3次后用200目紗布過(guò)濾所有藥液，并采用0.22μm有機(jī)濾膜抽濾，收集濾液得白術(shù)乙醇提取液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上述所得白術(shù)乙醇提取液濃縮至200 mL左右，真空干燥箱40℃干燥后得25 g白術(shù)乙醇提取物 （總得率12.5%，以下簡(jiǎn)稱白術(shù)提取物）。實(shí)驗(yàn)前以PBS配成所需濃度，實(shí)驗(yàn)劑量以白術(shù)提取物重量表示。

準(zhǔn)確稱取300 g黃芪藥材，加蒸餾水淹沒(méi)藥材浸泡30 min，分兩次煎煮。第一次加入10倍量的蒸餾水 （質(zhì)量比為黃芪 ∶水=1∶10），武火急煎至沸，再調(diào)文火煎煮1.5 h，收集濾液；接著加入6倍量的蒸餾水，文火煎煮1 h，合并兩次濾液，80℃水浴濃縮至300 mL（生藥含量1 g/mL），冷凍干燥得黃芪提取物固體粉末，-20℃保存待用。黨參提取物制備過(guò)程同黃芪提取物。實(shí)驗(yàn)前采用PBS溶解黃芪、黨參提取物以制備受試藥。實(shí)驗(yàn)劑量以黃芪、黨參提取物重量表示。

2.2 培養(yǎng)液配制 高糖DMEM加10%FBS、1× 104units/mL青霉素，10 mg/mL鏈霉素。其他濃度血清的培養(yǎng)液均在該配方基礎(chǔ)上加高糖DMEM作相應(yīng)稀釋。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)方法 細(xì)胞復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)瓶，于培養(yǎng)箱37℃，飽和濕度，95%空氣-5%CO2環(huán)境培養(yǎng)；隔天換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80% ～90%時(shí)，TrypLE消化液消化細(xì)胞，制作單細(xì)胞混懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，細(xì)胞分別以0.25、0.5、1、2、4、8×105個(gè)/m L的密度接種于6孔板 （考察接種密度），每孔加入2.5 mL培養(yǎng)液；加入含10%血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，Tip劃痕法造細(xì)胞遷移模型，分別加入含 0%、0.5%、1%、2%、4%、6%胎牛血清的完全培養(yǎng)液 （考察血清濃度），分別培養(yǎng)6、8、10、12、14、16 h后 （考察培養(yǎng)時(shí)間），觀察細(xì)胞遷移情況。EGF、AG1478和白術(shù)提取物則在建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蠹尤肱囵B(yǎng)液，作用質(zhì)量濃度分別為30、100、50、100、200μg/mL。

2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)方法 接種細(xì)胞前先用紅色標(biāo)記筆在6孔板各孔底部水平方向劃5條線，便于選取準(zhǔn)確的拍照位置。細(xì)胞接種于6孔板48 h后，吸棄培養(yǎng)液，用1 mL移液槍頭（Tips）在6孔板各孔中央沿直徑方向輕輕劃一條痕，劃痕時(shí)移液槍頭與6孔板成45度角。用PBS清洗細(xì)胞表面2次以去除漂浮的細(xì)胞和細(xì)胞殘骸，吸棄PBS。加入培養(yǎng)液培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后于劃痕和標(biāo)記線的交叉部位進(jìn)行拍照記錄。用NIH Image軟件（版本1.58）測(cè)量劃痕面積。IEC-6細(xì)胞遷移率等于（S0-ST）/ S0×100% （S0，0小時(shí)劃痕形成的面積；ST，培養(yǎng)T h后劃痕形成的面積）。每組3個(gè)復(fù)孔，所以n=15。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，然后方差分析，采用Dunnett法進(jìn)行組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞接種密度對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移的影響。課題組首先考察了IEC-6細(xì)胞的接種密度對(duì)細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)細(xì)胞以0.25×105個(gè)/mL的密度接種時(shí)，遷移率為0，可能是由于數(shù)量太少不足以在6孔板各孔中鋪滿，因而不能建立損傷后的遷移模型。當(dāng)細(xì)胞分別以0.5、1、2、4、8×105個(gè)/mL的密度接種時(shí)，細(xì)胞均能貼壁鋪滿，Tips劃痕后8 h觀察，各組的遷移 率 分 別 為 23.95%、36.03%、44.73%、53.50%、56.60%，遷移率隨著密度的增加而提高。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種的細(xì)胞密度為2或者大于2×105個(gè)/mL時(shí)，6孔板底部形成了多層貼壁的狀況，培養(yǎng)液中出現(xiàn)大量的漂浮的死細(xì)胞，提示接種密度不能大于2×105個(gè)/mL。為了使該遷移模型在后續(xù)的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中能呈現(xiàn)正向促進(jìn)和反向抑制的效果，課題組最終選擇1×105個(gè)/mL為最佳接種密度。

3.2 劃痕后不同觀察時(shí)間IEC-6細(xì)胞的遷移情況。

圖1 細(xì)胞接種密度對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移的影響Fig.1 Effect of cell density on IEC-6 cellm igration

黏膜損傷后的上皮快速修復(fù)與時(shí)間緊密相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)考察了Tips劃痕后不同時(shí)間段IEC-6細(xì)胞的遷移率。結(jié)果見(jiàn)圖2，數(shù)據(jù)顯示，遷移率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，損傷后6、8、10、12、14 h后遷移率分別為 28.76%、40.00%、51.18%、61.69%、68.97%。由于黏膜損傷后的修復(fù)主要包括上皮細(xì)胞遷移、增殖和分化等過(guò)程，并且隨著損傷時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖和分化逐漸發(fā)揮主要作用［3］，本研究旨在建立黏膜損傷修復(fù)早期的細(xì)胞遷移模型，因此，課題組選擇劃痕后8 h為最佳觀察時(shí)間。

圖2 劃痕后不同時(shí)間段對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移的影響Fig.2 Effect of scratch at different times on IEC-6 cellm igration

3.3 接種后不同血清濃度對(duì)IEC-6遷移的影響

胎牛血清 （FBS）是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物，它含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等，這些物質(zhì)可促進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、黏附、增殖［4］。因此，控制血清濃度對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移模型的建立至關(guān)重要。圖3結(jié)果顯示，在不含血清的培養(yǎng)液中，IEC-6細(xì)胞也表現(xiàn)出遷移的能力 （遷移率為11.89%），但細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，缺乏血清導(dǎo)致細(xì)胞萎縮、變形、脫落。當(dāng)血清濃度為0.5%時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)稍微改善，遷移率提高至26.56%，但仍然可以在培養(yǎng)液中看見(jiàn)一些懸浮的死細(xì)胞。當(dāng)血清濃度為1%和2%時(shí)，遷移率分別提高至40.7%和41.52%，細(xì)胞恢復(fù)至正常狀態(tài)。當(dāng)血清濃度為4%和6%時(shí)，遷移率分別為50.25%和55.63%。以上結(jié)果的偏差可能是由于血清濃度的提高促進(jìn)了IEC-6細(xì)胞增殖，細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞生長(zhǎng)加快。為了使細(xì)胞增殖對(duì)細(xì)胞遷移的影響降到最低，課題組最終選擇1%的血清濃度為最佳培養(yǎng)條件。

圖3 不同血清濃度對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移的影響Fig.3 Effect of different serum concentrations on IEC-6 cellm igration

3.4 IEC-6細(xì)胞遷移模型的評(píng)價(jià) 表皮生長(zhǎng)因子（EGF）是機(jī)體胃腸道發(fā)育和損傷修復(fù)的主要營(yíng)養(yǎng)因子，可促進(jìn)胃腸上皮細(xì)胞遷移，EGF是與靶細(xì)胞膜上表皮生長(zhǎng)因子受體 （EGFR）結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，EGFR普遍存在于胃壁細(xì)胞、十二指腸黏膜上皮細(xì)胞和小腸上皮細(xì)胞［5］。本實(shí)驗(yàn)采用外源性的EGF和EGFR阻斷劑AG1478來(lái)評(píng)價(jià)Tips劃痕法建立的遷移模型。結(jié)果如圖4所示，IEC-6細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板，Tips劃痕后加入含1%FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)8 h，空白組細(xì)胞遷移率為42.27%，EGF明顯地促進(jìn)了IEC-6細(xì)胞遷移，細(xì)胞遷移率為70.10% （與空白組比較P＜0.01）；加入AG1478則明顯抑制了細(xì)胞遷移，遷移率為25.73% （與空白組比較P＜0.01）。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示本課題組建立的IEC-6細(xì)胞遷移模型可檢測(cè)藥物的正向促進(jìn)遷移作用和負(fù)相抑制遷移作用。

圖4 EGF和AG1478對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移的影響（n= 15，x±s）Fig.4 Effect of EGF and AG1478 on IEC-6 cell m igration.A.diagram of cell m igration induced by Tips scratch；B.quantitative analysis of cell m igration rate of each group（n=15，x±s）

3.5 白術(shù)、黃芪、黨參提取物對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移的影響 本課題組前期采用手術(shù)刀片劃痕法建立了IEC-6細(xì)胞損傷后的遷移模型，并發(fā)現(xiàn)益氣健脾中藥白術(shù)、黃芪、黨參具有促進(jìn)IEC-6細(xì)胞遷移的作用，其機(jī)制可能與影響細(xì)胞內(nèi)多胺信號(hào)通路的相關(guān)指標(biāo)表達(dá)有關(guān)［6-9］。本實(shí)驗(yàn)采用Tips劃痕法遷移模型考察白術(shù)提取物對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移的作用效果，旨在進(jìn)一步驗(yàn)證Tips劃痕法模型的準(zhǔn)確性和可行性。白術(shù)提取物對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移的影響結(jié)果見(jiàn)圖5A、B?？瞻捉M胞遷移率為 35.78%，低劑量（50μg/m L）的白術(shù)提取物并沒(méi)有明顯地影響細(xì)胞遷移速度 （遷移率為 35.5%），中劑量 （100 μg/mL）和高劑量（200μg/mL）的白術(shù)提取物則明顯地促進(jìn)了IEC-6細(xì)胞遷移，遷移率分別為66.43%和67.1% （與空白組比較，均P＜0.01）。

黃芪提取物和黨參提取物對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移的結(jié)果見(jiàn)圖5C。本實(shí)驗(yàn)中空白組細(xì)胞遷移率為37.63%，50、100、200μg/mL的黃芪提取物均可促進(jìn)IEC-6細(xì)胞遷移，遷移率分別為58.43%、64.32%、65.86%，與空白組比較，均P＜0.01。黨參提取物低、中、高劑量組 （50、100、200 μg/mL）的細(xì)胞遷移率分別為59.33%、62.14%和66.25%，均顯著高于空白組細(xì)胞遷移率 （與空白組比較，均P＜0.01），提示黨參提取物可促進(jìn)IEC-6細(xì)胞遷移。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本課題組前期手術(shù)刀片劃痕法的結(jié)果相吻合，提示本研究建立的Tips劃痕法遷移模型穩(wěn)定可靠，可以作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀糜谖改c黏膜損傷后快速修復(fù)過(guò)程的體外藥效研究。

圖5 白術(shù)、黃芪和黨參提取物對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移的影響（n=15，x±s）Fig.5 Effects of Atractylodesmacrocephalae Rhizoma，AstragaliRadix，and Codonopsis Radix extracts on IEC-6 cellm igration（n=15，x±s）

4 討論

人體消化道黏膜表面上皮是由大量的多功能的上皮細(xì)胞組成，這些上皮細(xì)胞具有很強(qiáng)的再生能力，能保持每24～96 h更新一次。因此胃腸道黏膜在損傷后其表面上皮具有快速重建完整性的能力。上皮表面連續(xù)性的重建至少是通過(guò)三種不同的機(jī)制完成的［10］。首先，靠近損傷部位的上皮細(xì)胞向損傷區(qū)域遷移，并逐漸覆蓋損傷的裸露部位。這些遷移至損傷區(qū)域的上皮細(xì)胞并未開(kāi)始分化，它們的細(xì)胞骨架發(fā)生重組，接著形成偽足樣結(jié)構(gòu)，當(dāng)損傷部位完全密封后才開(kāi)始逐漸分化。本課題組又把這個(gè)過(guò)程稱為黏膜整復(fù)。無(wú)論是在體內(nèi)環(huán)境還是體外研究，胃腸黏膜上皮整復(fù)均發(fā)生在損傷后的幾個(gè)小時(shí)之內(nèi)［2］。其次，為了補(bǔ)充細(xì)胞池?fù)p失的細(xì)胞，上皮細(xì)胞接著會(huì)發(fā)生增殖。最后，為維持黏膜上皮的各種功能活性，未分化的上皮細(xì)胞逐漸成熟并分化。為方便研究，人為地將黏膜損傷修復(fù)劃分為三個(gè)過(guò)程，事實(shí)上，這3種痊愈機(jī)制在體內(nèi)并不是三個(gè)獨(dú)立的過(guò)程，它們往往相互重疊，本研究主要討論的是黏膜損傷后的第一個(gè)快速修復(fù)步驟—上皮細(xì)胞遷移過(guò)程。

IEC-6細(xì)胞來(lái)源于正常大鼠的小腸隱窩，其未分化的特性很好的模擬了人體的胃腸黏膜環(huán)境，人們普遍將其應(yīng)用于胃腸黏膜損傷的體外研究［11］。目前對(duì)IEC-6細(xì)胞損傷模型研究最多的兩個(gè)學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)分別是美國(guó)馬里蘭大學(xué)的Jian-ying Wang團(tuán)隊(duì)［12］和美國(guó)田納西州大學(xué)健康科學(xué)中心的Leonard R. Johnson團(tuán)隊(duì)［13］。前者主要采用手術(shù)刀片劃痕法建立IEC-6細(xì)胞損傷模型，后者則采用Tips劃痕法建立IEC-6細(xì)胞損傷后遷移模型。本課題組前期采用手術(shù)刀片劃痕法建立IEC-6細(xì)胞遷移模型，研究發(fā)現(xiàn)許多益氣健脾中藥的不同提取部位如黃酮、皂苷、多糖部位均可促進(jìn)IEC-6細(xì)胞遷移，其機(jī)制與影響細(xì)胞內(nèi)多胺含量有關(guān)［8-9，14-15］。但在實(shí)驗(yàn)中手術(shù)刀片劃痕法對(duì)實(shí)驗(yàn)者要求甚高，為了達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)效果，需花大量的時(shí)間進(jìn)行練習(xí)；即使是熟練操作的實(shí)驗(yàn)人員在同一次實(shí)驗(yàn)中也不可能全部劃出又細(xì)又直的劃痕，而劃痕的粗細(xì)直接影響細(xì)胞遷移的速度，因此劃痕的質(zhì)量直接決定了實(shí)驗(yàn)結(jié)果；由于手術(shù)刀片劃痕法存在操作不便、易產(chǎn)生誤差和假陽(yáng)性結(jié)果等缺點(diǎn)，因此本研究考察了另一種劃痕損傷的方法，即Tips劃痕法。

為建立穩(wěn)定、可靠的Tips劃痕法模型，本研究對(duì)IEC-6接種的細(xì)胞密度、劃痕后培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)液中血清濃度進(jìn)行了考察，并采用具有促進(jìn)細(xì)胞遷移作用的EGF、白術(shù)提取物、黃芪提取物和黨參提取物以及具有抑制細(xì)胞遷移作用的EGFR受體阻斷劑AG1478進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IEC-6細(xì)胞接種數(shù)量為1×105個(gè)/mL，給藥后培養(yǎng)時(shí)間8 h以及1%的血清濃度為建立Tips劃痕法模型的最佳條件。在驗(yàn)證該模型時(shí)，發(fā)現(xiàn)EGF顯著地促進(jìn)了IEC-6細(xì)胞遷移，AG1478則抑制了IEC-6細(xì)胞遷移，同時(shí)發(fā)現(xiàn)中劑量和高劑量 （100和200 μg/mL）的白術(shù)提取物可促進(jìn)IEC-6細(xì)胞遷移，此外，50、100、200μg/mL的黃芪提取物和黨參提取物均可促進(jìn)IEC-6細(xì)胞遷移。這些結(jié)果提示Tips劃痕法建立的遷移模型具有可靠性和穩(wěn)定性的特點(diǎn)。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾胃為氣血生化之源，后天之本。脾虛證患者和大鼠的胃腸黏膜都表現(xiàn)出上皮細(xì)胞脫落、壞死的情況。因此可以認(rèn)為胃腸黏膜損傷是脾虛證的重要病理基礎(chǔ)［16］。胃腸黏膜保護(hù)是中醫(yī) “脾”功能的重要內(nèi)容，也是益氣健脾中藥的重要作用機(jī)制之一。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)益氣健脾中藥促進(jìn)胃腸黏膜損傷后修復(fù)的作用機(jī)制與增加細(xì)胞內(nèi)多胺水平有關(guān)。而在本研究建立Tips劃痕法后，課題組的研究將從多胺介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路轉(zhuǎn)向EGFR介導(dǎo)的下游信號(hào)通路，Tips劃痕法模型的建立為本課題組后續(xù)的研究建立了良好的工作基礎(chǔ)。

［1］Mammen JM，Matthews JB.Mucosal repair in the gastrointestinal tract［J］.Crit CareMed，2003，31（Suppl8）：S532-537.

［2］Dignass A U.Mechanisms and modulation of intestinal epithelial repair［J］.Inflamm Bowel Dis，2001，7（1）：68-77.

［3］Iizuka M，Konno S.Wound healing of intestinal epithelial cells［J］.World JGastroenterol，2011，17（17）：2161-2171.

［4］Bieback K.Platelet lysate as replacement for fetalbovine serum in mesenchymal stromal cell cultures［J］.Transfus Med Hemother，2013，40（5）：326-335.

［5］Jones S，Rappoport JZ.Interdependent epidermal growth factor receptor signalling and trafficking［J］.Int JBiochem Cell Biol，2014，51（1）：23-28.

［6］胡 燦，李茹柳，盧文彪，等.IEC-6細(xì)胞遷移藥理實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒌难芯浚跩］.中藥材，2011，34（5）：738-746.

［7］胡 燦，李茹柳，王 靜，等.黃芪和白術(shù)提取物對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22（1）：61-65.

［8］Song H P，Li R L，Chen X，et al.Atractylodesmacrocephala Koidz promotes intestinalepithelial restitution via the polyamine-Voltage-gated K（+）channel pathway［J］.J Ethnopharmacol，2014，152（1）：163-172.

［9］宋厚盼，李茹柳，王一寓，等.白術(shù)提取物對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移過(guò)程多胺信號(hào)通路鈣離子調(diào)控的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（5）：1361-1367.

［10］Kemmerly T，Kaunitz J D.Gastroduodenal mucosal defense［J］.Curr Opin Gastroenterol，2013，29（6）：642-649.

［11］Gao JH，Guo L J，Huang Z Y，et al.Roles of cellular polyamines in mucosal healing in the gastrointestinal tract［J］.J Physiol Pharmacol，2013，64（6）：681-693.

［12］Rao JN，Rathor N，Zhuang R，et al.Polyamines regulate intestinal epithelial restitution through TRPC1-mediated Ca（2）+ signaling by differentially modulating STIM1 and STIM2［J］. Am JPhysiol Cell Physiol，2012，303（3）：C308-317.

［13］Ray R M，Bhattacharya S，Johnson L R.EGFR plays a pivotal role in the regulation ofpolyamine-dependentapoptosis in intestinal epithelial cells［J］.Cell Signal，2007，19（12）：2519-2527.

［14］李茹柳，曾 丹，溫 鵬，等.黨參黃酮提取物對(duì)小腸上皮細(xì)胞遷移及多胺的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2014，25（5）：523-526.

［15］王一寓，李茹柳，宋厚盼，等.白術(shù)多糖對(duì)IEC-6細(xì)胞遷移及細(xì)胞生長(zhǎng)的影響［J］.中藥藥理與臨床，2014，30（4）：51-54.

［16］尹光耀，張武寧，何雪芬，等.脾虛證胃粘膜組織細(xì)胞病理學(xué)研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1999，19（11）：660-663.

Study on the effect of Baizhu，Huangqi，and Dangshen on promoting IEC-6 cell repair after injury

SONG Hou-pan， XIE Meng-zhou， HU Zhi-xi， HUANG Hui-yong*， CAIXiong*
（Institute of TCM Diagnostics，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

AIMTo study the effect of Baizhu（Atractylodesmacrocephalae Rhizoma），Huangqi（Astragali Radix），and Dangshen（Codonopsis Radix）extracts on the rapid repair of gastrointestinal mucosa injury in vitro.METHODSThe gastrointestinalmucosa injurymodel was established by Tips scratch method.The effect of three kinds of extracts on the repair was studied in three areas：different cell seeding densities，rapid repair time after the scratch，and serum concentration.The cellmigrationmodelwas then evaluated by EGF and AG1478.Finally，we examined the effectof three kinds of extracts on IEC-6 cellmigration.RESULTS（1）The optimal culture density of intestinal epithelial cell（IEC-6）was1×105 cells/mL；（2）IEC-6 cellmigration rate should be calculated 8 h after scratch；（3）The serum concentration of 1%was the most suitable concentration；（4）Epidermal growth factor（EGF）significantly promoted IEC-6 cellmigration，while AG1478 significantly inhibited IEC-6 cellmigration；（5）Baizhu，Huangqi，and Dangshen extracts all increased the rate of IEC-6 cellmigration.CONCLUSIONTraditional Chinesemedicines of replenishing qi to invigorate the spleen can promote the repair of gastrointestinalmucosal injury，whether the mechanism is related to EGFR signaling pathway remains to be further studied.

gastrointestinalmucosal injury；intestinal epithelial cell；cellmigration model；epidermal growth factor（EGF）；Bazhu（Atractylodesmacrocephalae Rhizoma）；Huangqi（Astragali Radix）；Dangshen（Codonopsis Radix）

R285.5

：A

：1001-1528（2015）06-1170-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.004

2014-10-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81373540）；湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目 （201308）；湖南省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（12A107）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放基金項(xiàng)目 （2013ZYZD10）；湖南省科技重大專項(xiàng) （2014FJ1007）

宋厚盼 （1988—），男，博士，講師，從事中醫(yī)診斷學(xué)和中藥消化道藥理學(xué)研究工作。E-mail：pansyy-2008@163.com

*通信作者：蔡 雄 （1976—），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥抗炎免疫藥理學(xué)和分子生物學(xué)與遺傳學(xué)研究。E-mail：caix12@qq.com黃惠勇 （1963—），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中醫(yī)病證診斷規(guī)范及信息處理研究。E-mail：huanghy@126.com