丁 農(nóng)， 張金衛(wèi)， 金瑞豐， 李江濤， 馮世明， 魚(yú)南洋， 陸 萍， 李衛(wèi)旗*

(1.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江湖州 313000；2.浙江大學(xué)湖州市南太湖現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技推廣中心，浙江湖州 313000)

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天然彩色蠶繭繭層中色素含量及抗氧化物活性的測(cè)定

丁 農(nóng)1， 張金衛(wèi)1， 金瑞豐1， 李江濤1， 馮世明1， 魚(yú)南洋1， 陸 萍2， 李衛(wèi)旗2*

(1.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江湖州 313000；2.浙江大學(xué)湖州市南太湖現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技推廣中心，浙江湖州 313000)

[目的] 為彩色繭蠶絲蛋白應(yīng)用于化妝品等產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。[方法]對(duì)幾個(gè)不同顏色的彩色繭蠶品種進(jìn)行繭層色素含量和抗氧化性能測(cè)定。[結(jié)果] 綠色繭繭殼中類黃酮色素的含量最高，為0.521 mg/g，是白色繭的4.65倍;黃色繭繭殼次之，而白色繭和紅色繭最低。黃色繭和紅色繭類胡蘿卜素含量均在0.5 mg/g以上，是白色繭和綠色繭的8倍以上。綠色繭繭層中抗氧化物活性最高，為217.5 U/g；黃繭繭層中抗氧化物活性次之，而紅繭和白繭較低。[結(jié)論]與白色蠶繭相比，綠色蠶繭含有較高的類黃酮，而黃色繭和紅色繭有較高的類胡蘿卜素，抗氧化能力也是天然彩色繭顯著高于白色繭。

天然彩色繭；色素含量；抗氧化物；測(cè)定

繭絲的化學(xué)組成主要有絲素和絲膠2種蛋白質(zhì)，其占比絲素蛋白約為75%，絲膠蛋白約為25%。我國(guó)的蠶繭生產(chǎn)除了主要作為絲綢服飾面料及蠶絲被的原料外，正在向生物醫(yī)藥材料、化妝品材料和保健食品材料等非傳統(tǒng)應(yīng)用領(lǐng)域的拓展[1]。繭色受控于基因表達(dá)的天然彩色繭品種由于其繭絲中的色素來(lái)源于蠶食下的桑葉或蠶體內(nèi)的合成，色澤柔和、自然及環(huán)保，其開(kāi)發(fā)利用價(jià)值已經(jīng)引起人們的重視，可共生產(chǎn)應(yīng)用的天然彩色繭品種也相繼育成[2]。與普通白色繭相比，天然彩色繭富含有類黃酮色素和類胡蘿卜素色素等生物活性物質(zhì)，在繅絲生產(chǎn)過(guò)程也產(chǎn)生大量的富含天然有機(jī)色素的繭衣和下繭、長(zhǎng)吐等下腳料副產(chǎn)品，如果將它們回收二次利用，作為富含類黃酮、類胡蘿卜素的蠶絲蛋白原料開(kāi)發(fā)化妝品等產(chǎn)品將對(duì)資源的綜合利用和保護(hù)環(huán)境都有十分重要的意義。筆者對(duì)選育的幾個(gè)不同顏色的彩色繭品種進(jìn)行了繭層色素含量與抗氧化性能測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試品種。選育的黃色繭金玉、綠色繭LJ、紅色繭RC，以白色繭秋豐為對(duì)照。

1.1.2主要試劑。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、β-胡蘿卜素、標(biāo)準(zhǔn)SOD(15KU)、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶(均為Sigma公司產(chǎn)品)以及甲-萘胺、鹽酸羥胺、對(duì)氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、75%乙醇和磷酸緩沖液(65 mmol/L，pH 7.8)。所用試劑均為分析純。

1.1.3主要儀器。島津 UV-2450紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、超聲波儀、電熱恒溫水浴鍋、立式壓力蒸汽滅菌器、恒溫烘箱。

1.2 方法

1.2.1蠶繭繭殼中色素和抗氧化物的提取。取干凈的供試蠶繭繭殼用純水洗滌后冷風(fēng)吹干，剪碎后用電子天平準(zhǔn)確稱取0.5 g，放入潔凈試管中，加入10 ml 75%的乙醇，然后超聲波儀超聲30 min，再在60 ℃的水浴鍋里抽提4 h，過(guò)濾后去除雜質(zhì)，收集第1次抽提的濾液，將剩余的殘?jiān)貜?fù)抽提1次，將濾液合并定容于25 ml標(biāo)準(zhǔn)容量瓶中，放置于4 ℃的冷藏箱中過(guò)夜，測(cè)定時(shí)吸取上層液作為試驗(yàn)的試樣液。

1.2.2黃酮類色素的測(cè)定。類黃酮的測(cè)定采用硝酸鋁顯色法[3]，具體原理為黃酮化合物在有亞硝酸鈉和中性條件下與鋁鹽反應(yīng)生成螯合物，在加入氫氧化鈉溶液后呈現(xiàn)紅橙色，在499 nm處有最大吸收波峰，然后用比色法測(cè)定黃酮類化合物的含量。

1.2.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。用電子天平準(zhǔn)確稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用50 ml的容量瓶定容為0.2 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、4、5和6 ml后加入5%的NaNO2溶液300 μl，混勻后靜置6 min，再加入10%的Al(NO3)3溶液300 μl，混勻后靜置6 min，然后加入1 mol/L NaOH溶液4 ml，混勻后加入75%的乙醇定容為25 ml，使蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為0、0.008、0.016、0.032、0.040和0.048 mg/ml，在波長(zhǎng)499 nm下測(cè)定其吸光度值，空白對(duì)照用純水作同樣處理，3次重復(fù)。得到回歸方程為：Y=12.329 9X-0.000 3，相關(guān)系數(shù)為R2=0.998 9。測(cè)試樣品的濃度與其對(duì)應(yīng)的吸光度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖1)。

1.2.2.2試樣黃酮類色素含量的測(cè)定。取試樣液5 ml，加入5%的NaNO2溶液300 μl，搖勻靜置6 min后再加入10%的Al(NO3)3溶液300 μl，混勻靜置6 min后加入1 mol/L NaOH溶液4 ml，混勻后再加入75%的乙醇定容至10 ml，然后用分光光度計(jì)于499 nm處測(cè)定其吸光度，空白對(duì)照用純水并作相同處理。根據(jù)檢測(cè)到的吸光度值計(jì)算出樣品中的類黃酮含量，然后依據(jù)將0.5 g繭殼抽提出25 ml的試樣液和稀釋倍數(shù)，計(jì)算出供試蠶繭單位重量繭殼的類黃酮含量。

1.2.3類胡蘿卜素的測(cè)定。類胡蘿卜素的測(cè)定采用光度法測(cè)定[4]，具體原理為：類胡蘿卜素易溶于有機(jī)溶劑而不溶于水，可用乙醚提取分離。皂化劑KOH-CH3OH能與供試液中的類黃酮及含羧基、羥基的色素生成可溶于水的鹽，類胡蘿卜素則無(wú)此類反應(yīng)，因而可用乙醚將類胡蘿卜素抽提出來(lái)，達(dá)到將類胡蘿卜素與其他色素分離的目的。β-胡蘿卜素的最大吸收波峰是449 nm，采用比色法對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定試樣液含量。

1.2.3.1β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。用電子天平精確稱取β-胡蘿卜素0.5 mg，置于50 ml的容量瓶中加入75%的乙醇溶液定容成為0.01 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，分別取0、1、2、4、5和6 ml 0.01 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液置于25 ml的容量瓶中，得到0、0.4、0.8、1.6、2.0和2.4 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后，在波長(zhǎng)449 nm處測(cè)定其吸光度，空白對(duì)照用純水作同樣處理，3次重復(fù)。得到回歸方程為Y=0.163 8X-0.004 3，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 7。從圖2可以看出，β-胡蘿卜素濃度與其對(duì)應(yīng)的吸光度值具有良好的線性關(guān)系。

1.2.3.2試樣類胡蘿卜素含量的測(cè)定。取供試液1 ml，加入20%質(zhì)量比的KOH-CH3OH溶液2.5 ml，置于4 ℃冷藏箱遮光條件下過(guò)夜，用分液漏斗加乙醚5 ml，將供試液移入再加入10%的NaCl溶液5 ml，靜置分層后將上層濾液移入小燒杯，對(duì)下層液繼續(xù)萃取，合并濾液，用10%的NaC溶液l5 ml洗滌4次，再倒入同樣的燒杯中，加入2 g無(wú)水Na2SO4干燥處理30 min，然后用乙醚定容至10 ml，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)449 nm處測(cè)定其吸光度值，對(duì)照用純水作同樣處理。根據(jù)吸光度值，計(jì)算出供試樣類胡蘿卜素的含量，然后依據(jù)0.5 g繭殼樣品抽提為25 ml的供試液和測(cè)試液的稀釋倍數(shù)計(jì)算出供試蠶繭單位重量繭殼的類胡蘿卜素含量。

1.2.3抗氧化物的測(cè)定。采用黃嘌呤氧化-羥胺法[5]測(cè)定試樣的抗氧化物SOD(超氧化物歧化酶)值，具體原理為:黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基(O2-)，與羥胺反應(yīng)生成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與甲萘胺和對(duì)氨基苯磺酸反應(yīng)生成紅色化合物，用分光光度計(jì)在530 nm下進(jìn)行比色測(cè)定，而超氧化物歧化酶抑制此反應(yīng)，使得超氧陰離子自由基(O2-)與羥胺反應(yīng)產(chǎn)生的亞硝酸鹽減少，據(jù)此來(lái)建立SOD百分抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將供試樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線對(duì)照，按照以下公式計(jì)算出供試樣品提取液的抗氧化活性：SOD百分抑制率(%)=(對(duì)照管吸光度值-測(cè)定管吸光度值)/對(duì)照管吸光度值×100。

表1 SOD活性測(cè)定的方法

1.2.3.1SOD標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的建立。將標(biāo)準(zhǔn)品SOD用65 mmol/L的磷酸緩沖液配制成750 U/ml的溶液后稀釋50倍，稀釋成15 U/ml的SOD標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后，再將其分別稀釋為0、0.005、0.025、0.045、0.065、0.085、0.105、0.125、0.145、0.165和0.205 U/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。最后，采用黃嘌呤氧化-羥胺法測(cè)定SOD的活性并建立標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。SOD的測(cè)定方法見(jiàn)表1。

按上述方法對(duì)SOD各濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液的活性測(cè)定，得到相對(duì)應(yīng)濃度的SOD抑制率，建立SOD的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。從圖3可以看出，抑制率在65%以內(nèi)時(shí)其SOD標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的線性良好。

1.2.3.2試樣抗氧化物的測(cè)定。取按照“1.2.1”中的方法得到的供試液的上層液20 μl，測(cè)定試樣的吸光度，計(jì)算試樣液的SOD百分抑制率，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線獲得供試液的抗氧化活性。

供試蠶繭單位重量繭殼的抗氧化物含量(U/g)，是將供試樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)與SOD標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線進(jìn)行比對(duì)，將檢測(cè)樣品的百分抑制率所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液SOD濃度值設(shè)定為W(SOD)(單位為U/ml)，再根據(jù)試樣的稀釋倍數(shù)按照以下公式計(jì)算：繭層的抗氧化物(U/g)=[W(SOD) U/ml×5.8 ml×25 ml]/(0.02 ml×0.5 g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同色彩蠶品種繭殼的類黃酮色素含量從表2可以看出，綠色繭品種LJ繭殼中的類黃酮含量最高，達(dá)到0.521 mg/g，大幅高于其他品種，分別為黃色繭HJ、紅色繭RC和白色繭品種秋豐的2.56倍、3.64倍和4.65倍。

表2 不同色彩蠶品種繭殼的類黃酮含量

2.2 不同色彩蠶品種繭殼的類胡蘿卜素含量從表3可以看出，黃色繭品種金玉與紅色繭品種RC的類胡蘿卜素含量較高，其中黃色繭金玉為0.508 mg/g、紅色繭RC為0.529 mg/g，是白色繭秋豐和綠色繭LJ的8～10倍左右。

2.3 不同色彩蠶品種繭殼的抗氧化物活性從表4可以看出，各種色彩的蠶繭均有抗氧化活性，其大小順序依次為綠色繭LJ>黃色繭>紅色繭RC>白色繭秋豐。由此可見(jiàn)，彩色繭與白色繭相比具有更高的抗氧化活性。

表3 不同色彩蠶品種繭殼的類胡蘿卜素含量

表4 不同色彩彩色繭繭層抗氧化性的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

結(jié)果表明，與白色蠶繭相比天然綠色蠶繭含有較高的類黃酮，而天然黃色繭和紅色繭有較高的類胡蘿卜素，抗氧化能力也是天然彩色繭顯著高于白色繭?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)證實(shí)類黃酮和類胡蘿卜素具有多種生理調(diào)節(jié)功能，其中類黃酮具有抗疲勞、調(diào)節(jié)血糖和抗自由基等功能，而類胡蘿卜素具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力等作用[6-9]。SOD作為生物體內(nèi)的一種極為重要的天然抗氧化物，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，具有生命體消除新陳代謝過(guò)程中有害物質(zhì)的重要功能，可以有效清除自由基，提高免疫力和抗衰老[10]。選育天然彩色繭品種，生產(chǎn)開(kāi)發(fā)天然彩色絲產(chǎn)品特別是保健內(nèi)衣，產(chǎn)品色澤柔美，加工無(wú)需印染更加環(huán)保，而且含有天然色素和抗氧化物對(duì)皮膚的保健及親和力更好，符合人們對(duì)“健康、綠色”的追求。目前，以SOD為主要護(hù)膚成分的化妝品和以蠶絲蛋白為主要護(hù)膚成分的化妝品層出不窮，以天然彩色繭原料開(kāi)發(fā)出含有天然色素和抗氧化物質(zhì)的蠶絲蛋白化妝品由于其天然環(huán)保的特點(diǎn)將會(huì)受到市場(chǎng)的更加青睞。筆者對(duì)保存的彩色繭育種材料進(jìn)行了色素及抗氧化活性檢測(cè)，由于彩色繭品種育種素材眾多，各種繭色相似的彩色繭品種其色素和抗氧化活性表現(xiàn)是否一致，還有待于進(jìn)一步研究。

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Determination of Pigment Contents and Antioxidant Property in the Shell of Natural Colorful Silkworm Cocoon

DING Nong1, ZHANG Jin-wei1, JIN Rui-feng1, Li Wei-qi2*et al

(1. Huzhou Academy of Agricultural Sciences, Huzhou, Zhejiang 313000; 2. South Taihu Agricultural Technology Extension Center of Zhejiang University, Huzhou, Zhejiang 313000)

[Objective] The research aimed to provide basis for the cosmetics development of colorful cocoon silk protein. [Method] The pigment contents and antioxidant property of shell of several natural colorful cocoon varieties were determined. [Result] The content of flavonoid in green cocoons was the highest (0.521 mg/g), which was 4.65 times as that in white cocoons. The content of flavonoid in yellow cocoons was the second and that in white cocoons and red cocoons. The content of carotenoid in yellow cocoons and red cocoons were all more than 0.5 mg/g, which was 8 times higher than white cocoons. In addition, the antioxidant activity in green cocoons were the highest (217.5 U/g), followed by that in yellow cocoons. The antioxidant activity in white cocoons and red cocoons was lower. [Conclusion] Compared with white cocoons, green cocoons had higher content of flavonoid, and yellow cocoons and red cocoons had higher content of carotenoid. And the antioxidant activity in natural colorful cocoon was higher than that in white cocoons.

Natural colorful cocoon; Pigment contents; Antioxidant; Determination

浙江省公益技術(shù)研究項(xiàng)目(2014C32085)； 湖州市科技攻關(guān)項(xiàng)目(2013GZ09)。

丁農(nóng)(1961- )，男，浙江德清人，高級(jí)農(nóng)藝師，從事蠶桑科研與技術(shù)推廣。*通訊作者，副教授，從事農(nóng)產(chǎn)品加工科研與教學(xué)。

2015-03-12

S 886

A

0517-6611(2015)11-139-03