張婉蓉，徐含穎，張學(xué)舒，馮雙雙，羅燕兒

(浙江海洋學(xué)院，浙江舟山 316022)

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不同養(yǎng)殖模式下對蝦早期死亡綜合癥致病菌的動態(tài)變化

張婉蓉，徐含穎，張學(xué)舒*，馮雙雙，羅燕兒

(浙江海洋學(xué)院，浙江舟山 316022)

[目的] 為指導(dǎo)南美白對蝦高位池的科學(xué)養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。[方法]選取2種養(yǎng)殖模式的南美白對蝦高位池塘為試驗對象，通過周期性的水樣采集研究了蝦池水體細菌數(shù)量、弧菌數(shù)量以及弧菌中非副溶血弧菌和副溶血弧菌比例變化規(guī)律與早期死亡綜合癥發(fā)生的相關(guān)性。[結(jié)果]試驗蝦池在養(yǎng)殖初期弧菌數(shù)量較低，養(yǎng)殖過程中弧菌數(shù)量與細菌總數(shù)的消長趨勢基本一致。當(dāng)蝦池中細菌總數(shù)高于2.5×104cfu/ml，弧菌數(shù)量高于1.5×103cfu/ml，非副溶血弧菌與副溶血弧菌的比例超過10∶1，蝦池內(nèi)極易發(fā)生早期死亡綜合癥。[結(jié)論] 該研究結(jié)果可用于進行對蝦健康養(yǎng)殖的風(fēng)險評估。

南美白對蝦；細菌；弧菌；養(yǎng)殖模式

南美白對蝦是目前世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦種之一,南美白對蝦生長速度快、出肉率高，且營養(yǎng)需求低、抗逆性強，是一種優(yōu)良的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。隨著大規(guī)模的高密度養(yǎng)殖的進行，集約化程度不斷提高，南美白對蝦發(fā)生病害愈來愈頻繁。從2009年起，一種名為早期死亡綜合癥(Early mortality syndrome,EMS)的對蝦疾病開始肆虐亞洲各國對蝦養(yǎng)殖區(qū)[1]，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。盡管目前對早期死亡綜合癥的致病機理研究并不透徹，但眾多學(xué)者普遍認為該疾病是由副溶血弧菌直接或間接作用對蝦導(dǎo)致死亡[2-3]。弧菌病是養(yǎng)殖對蝦的主要細菌病害之一，能引起水產(chǎn)動物魚、蝦類等大量死亡，往往與暴發(fā)性流行病有關(guān)[4-12]。筆者研究了在養(yǎng)殖進程中采用不同疾病防控措施的高位蝦池從放苗到收蝦的養(yǎng)殖過程中水體細菌和弧菌數(shù)量的動態(tài)變化，對“規(guī)范化南美白對蝦養(yǎng)殖水體中細菌和弧菌總量關(guān)鍵限值”[13-14]進行對應(yīng)性檢驗，用于評估對蝦健康養(yǎng)殖風(fēng)險，為指導(dǎo)南美白對蝦高位池的科學(xué)養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗池塘與養(yǎng)殖進程選定舟山市(金浦養(yǎng)殖場)和臺州市(誠達養(yǎng)殖場)2個養(yǎng)殖場各4口養(yǎng)殖池和1口水源處理池作為追蹤檢測對象，從2個養(yǎng)殖場各選2口養(yǎng)殖池的檢測結(jié)果作為研究內(nèi)容。試驗所用養(yǎng)殖池均為南美白對蝦規(guī)范化高位養(yǎng)殖池，面積為2 000～3 335 m2/池，池形正方，中央排污，有效水深1.8 m，池底鋪防滲膜，配備底增氧和水面增氧系統(tǒng)。

養(yǎng)殖流程按照《南美白對蝦高位池養(yǎng)成技術(shù)規(guī)范》[15]執(zhí)行。金浦養(yǎng)殖場在按照南美白對蝦高位池養(yǎng)成技術(shù)規(guī)范進行養(yǎng)殖的基礎(chǔ)上，定期在養(yǎng)殖池中進行鹵素消毒劑帶蝦消毒，在飼料中拌服針對性抗生素，用于疾病防控。誠達養(yǎng)殖場在養(yǎng)殖過程中不進行鹵素消毒劑帶蝦消毒，在飼料中拌服微生物制劑、大蒜素和VC等，用于提高對蝦的抗病能力。

1.2 儀器與試劑

1.2.1設(shè)備。滿足細菌數(shù)量檢測和細菌種類分離鑒定的完整試驗條件。

1.2.2試劑。檢測細菌總數(shù)的培養(yǎng)基平板為營養(yǎng)瓊脂平板，由上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；檢測弧菌總數(shù)的培養(yǎng)基平板為TCBS瓊脂平板，由上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗方法采用稀釋平板涂布法對檢測池水中的細菌總數(shù)、弧菌數(shù)量和弧菌菌比進行測定。從對蝦放苗到收獲1個養(yǎng)殖周期內(nèi)，每隔15 d進行1次養(yǎng)殖水體的水樣采集，分別測定細菌總數(shù)、弧菌數(shù)量以及弧菌菌比，通過對試驗數(shù)據(jù)的整理分析，探討高位蝦池細菌總數(shù)、弧菌數(shù)量變化及弧菌菌比與對蝦EMS癥發(fā)生的相關(guān)性。

1.3.1采樣方法。2014年6～9月進行養(yǎng)殖水環(huán)境細菌數(shù)量跟蹤檢測，所有檢測池每隔15 d進行1次采樣，現(xiàn)場稀釋、涂布水樣，接種平板在實驗室恒溫培養(yǎng)。細菌采用營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)，弧菌采用TCBS平板培養(yǎng)。接種后的平板放入恒溫培養(yǎng)箱，34 ℃下培養(yǎng)24 h后計數(shù)菌落數(shù)量。

1.3.2菌落特征。在TCBS平板上副溶血弧菌的菌落呈圓形，邊緣整齊、濕潤、稍混濁、半透明，多數(shù)具尖心，斗笠狀，藍綠色。非副溶血弧菌(其他弧菌)的菌落稍大，光滑，黃色，稍平。

1.4 數(shù)據(jù)處理利用Excel對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計并繪圖，分析其相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦池內(nèi)細菌數(shù)量的變化情況由表1可知， A3和C7養(yǎng)殖池中細菌總數(shù)及弧菌數(shù)量基本呈現(xiàn)隨養(yǎng)殖進程而增高的走勢；副溶血弧菌數(shù)量在養(yǎng)殖初期為0；此后菌比值隨養(yǎng)殖進程有明顯變化，呈上升趨勢，并且表現(xiàn)出副溶血弧菌含量明顯升高的現(xiàn)象——非副溶血弧菌與副溶血弧菌比均超過10∶1。

此外，在檢測過程中水源處理池(消毒池)內(nèi)只檢測到低含量的細菌數(shù)(<200 cfu/ml)和弧菌數(shù)(<10 cfu/ml)。在末次檢測后的次日(7月2日)，C7蝦池內(nèi)出現(xiàn)典型EMS癥，對蝦大批死亡，排塘；7月4日，A3蝦池出現(xiàn)典型EMS癥，對蝦大批死亡，排塘。

表1 誠達養(yǎng)殖場蝦塘細菌的檢測結(jié)果

池號采樣日期養(yǎng)殖時間∥d細菌總數(shù)104cfu/ml弧菌總數(shù)103cfu/ml非綠/綠A305-31183．900．1810∶006-15330．690．1310∶3．007-01483．802．8010∶9．3C705-31071．040．0810∶006-15220．900．1510∶2．507-01374．905．9010∶4．5

注:非綠/綠為非副溶血弧菌與副溶血弧菌比。

表2 金浦養(yǎng)殖場蝦塘細菌的檢測結(jié)果

池號采樣日期養(yǎng)殖時間∥d細菌總數(shù)104cfu/ml弧菌總數(shù)103cfu/ml非綠/綠8#07-06020．02010∶007-19162．142．7010∶0．508-05330．380．4010∶3．308-20481．380．3010∶2．009-05650．050．0310∶009-20800．270．4810∶1110-06950．250．2510∶7311#07-06020．02010∶007-19160．701．5010∶0．908-05330．301．7610∶2．008-20480．151．0510∶5．209-05650．030．0110∶2．309-20801．652．2010∶3．410-06950．200．0910∶10

注:非綠/綠為非副溶血弧菌與副溶血弧菌比。

由表2可知，在全養(yǎng)殖期內(nèi)8#和11#養(yǎng)殖池中細菌總數(shù)均低于2.5×104cfu/ml，弧菌數(shù)量除個別時段基本處于1.5×103cfu/ml以下；副溶血弧菌數(shù)量在養(yǎng)殖初期檢測時為0；菌比值隨養(yǎng)殖進程有所變化，基本呈上升趨勢，且表現(xiàn)出副溶血弧菌含量明顯升高的現(xiàn)象——非副溶血弧菌與副溶血弧菌比均超過10∶1。

此外，在檢測過程中水源處理池(消毒池)內(nèi)僅檢測到低含量的細菌數(shù)(<200 cfu/ml)和弧菌數(shù)(<10 cfu/ml)。金浦養(yǎng)殖場全場12口養(yǎng)殖池在整個養(yǎng)殖期未出現(xiàn)明顯的EMS疾病現(xiàn)象，獲得良好的養(yǎng)殖效果，于10月初陸續(xù)收捕，平均產(chǎn)量超過1.8 kg/m2。

2.2 蝦池內(nèi)細菌數(shù)量和弧菌數(shù)量的變化從圖1可以看出，金浦養(yǎng)殖場 8#和11#蝦池細菌數(shù)量的變化范圍為0.023×104cfu/ml～2.14×104cfu/ml，在2.5×104cfu/ml以下，平均值分別為0.64×104和0.44×104cfu/ml，方差分別為0.65和0.34，波動變化較小。誠達養(yǎng)殖場A3和C7蝦池細菌數(shù)量的變化范圍為0.69×104～3.90×104cfu/ml，平均值分別為2.30×104和0.97×104cfu/ml，方差分別為3.33和5.15，波動較為劇烈，2個蝦池的細菌數(shù)量均在第3次采樣時呈現(xiàn)爆發(fā)性增長。

從圖2可以看出，金浦養(yǎng)殖場8#和11#水體弧菌數(shù)量呈波動變化，范圍為0～2.70×103cfu/ml,平均值分別為0.59×103和0.94×103cfu/ml，方差分別為0.89和0.84，數(shù)量變化基本在1.5×103cfu/ml以下。誠達養(yǎng)殖場A3和C7蝦池在前2次檢測時弧菌數(shù)量為0.08～0.18×103cfu/ml，最高值為0.18×103cfu/ml，弧菌數(shù)量較低。然而，在第3次檢測時發(fā)現(xiàn)，弧菌數(shù)量短時間內(nèi)爆發(fā)性增長，遠超于1.5×103cfu/ml。A3和C7蝦池檢測結(jié)果的方差分別為2.33和11.16，弧菌數(shù)量的變化幅度較大。

綜上可知，同一個位點細菌和弧菌數(shù)量呈現(xiàn)規(guī)律性的同步增多或減少。方差分析表明，弧菌數(shù)量的變化與細菌數(shù)量相比顯得更不穩(wěn)定。

3 結(jié)論與討論

該研究中細菌數(shù)量變化與養(yǎng)殖進程沒有表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，與申玉春等[16]報道的高位蝦池細菌總數(shù)隨養(yǎng)殖過程逐步上升、后期最多的結(jié)果不同。這可能是人工因素和環(huán)境因子綜合作用的結(jié)果。章潔香等[17]也認為池中異養(yǎng)細菌和弧菌的數(shù)量受多方面因素尤其是人為因素的綜合影響。

3.1 2種養(yǎng)殖模式下細菌數(shù)量的變化規(guī)律2個養(yǎng)殖場的水處理池中細菌數(shù)量與弧菌數(shù)量都非常低。養(yǎng)殖前期，養(yǎng)殖池中的細菌數(shù)量與弧菌數(shù)量也呈低含量狀態(tài)。這表明《南美白對蝦高位池養(yǎng)成技術(shù)規(guī)范》在水源水的處理中是有效的。誠達養(yǎng)殖場(A3、C7)養(yǎng)殖進程中細菌數(shù)量與弧菌數(shù)量均呈上升走勢，且在嚴重超限后發(fā)生EMS癥，導(dǎo)致排塘結(jié)果。金浦養(yǎng)殖場(8#、11#)養(yǎng)殖進程中細菌數(shù)量始終低于2.5×104cfu/ml，弧菌數(shù)量在1.5×103cfu/ml附近波動。筆者認為這種現(xiàn)象應(yīng)該是后者定期在養(yǎng)殖池中進行鹵素消毒劑帶蝦消毒，始終抑制水中的細菌數(shù)量結(jié)果。

2個養(yǎng)殖場水體中弧菌數(shù)量中非副溶血弧菌與副溶血弧菌的比例均呈現(xiàn)隨養(yǎng)殖進程而升高的趨勢，但由于水中弧菌總數(shù)的差異，2個養(yǎng)殖場養(yǎng)殖池水中副溶血弧菌的含量也有明顯差異。同期進行的蝦體弧菌含量輔助檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水體弧菌數(shù)量上升時，蝦體肝胰腺和腸道中的弧菌也隨之上升。該試驗結(jié)果表明當(dāng)水體弧菌超過一定數(shù)量時，蝦池內(nèi)極可能發(fā)生對蝦患EMS癥大規(guī)模死亡現(xiàn)象。

2個養(yǎng)殖場都曾出現(xiàn)細菌數(shù)量過高的現(xiàn)象，而養(yǎng)殖結(jié)果卻表現(xiàn)出明顯差異。2個養(yǎng)殖場的主要區(qū)別體現(xiàn)在養(yǎng)殖管理和疾病防控模式的不同。誠達養(yǎng)殖場采用肥水養(yǎng)蝦，養(yǎng)殖過程中在蝦池內(nèi)不進行消毒，主要以在飼料中添加護肝藥物(如大蒜素和微生物制劑)來提高抗病能力，無其他對弧菌針對性藥物施用。金浦養(yǎng)殖場采用清水養(yǎng)蝦，陳超然等[18]的研究結(jié)果表明采用ClO2溶液潑灑，對養(yǎng)殖蝦池水中的細菌具有明顯殺滅作用，所以定期對養(yǎng)殖池進行帶蝦消毒(ClO2)。王永勝等[19]研究發(fā)現(xiàn)抗生素可以提高凡納濱對蝦肝臟中的抗菌力, 在飼料中拌入允許使用的抗生素，限制養(yǎng)殖池水中和對蝦體內(nèi)細菌，特別是弧菌的數(shù)量。

3.2 關(guān)于南美白對蝦高位池養(yǎng)殖的思考養(yǎng)殖過程中控制細菌的數(shù)量是至關(guān)重要的，養(yǎng)殖池水中細菌數(shù)量在2.5×104cfu/ml以下時較為安全，這與郭平等[20]對對蝦養(yǎng)殖水域環(huán)境細菌動態(tài)變化研究中富營養(yǎng)水域細菌數(shù)相近。其中，大多數(shù)弧菌在養(yǎng)殖系統(tǒng)中是一類重要的致病菌或條件致病菌，養(yǎng)殖過程中控制蝦池水體的弧菌數(shù)與預(yù)防蝦病的發(fā)生有關(guān)[21]。許多學(xué)者將104cfu/ml作為對蝦發(fā)病的弧菌數(shù)量閾值[22]，但筆者發(fā)現(xiàn)弧菌數(shù)量在1.5×103cfu/ml以下時較為安全，與占國等[23]認為使對蝦感染發(fā)病的弧菌數(shù)量閾值為1×103～1×104cfu/ml基本接近。此外，菌比值也是需要予以關(guān)注的指標(biāo)。非副溶血弧菌與副溶血弧菌的比例應(yīng)低于10∶1。不同的疾病防控措施表現(xiàn)出明顯不同的養(yǎng)殖成效，建議對南美白對蝦高位池養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范中疾病防控的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)作適應(yīng)性補充或修改。

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Dynamic Changes of Pathogen of Early Mortality Syndrome ofLitopennausvannameiunder Different Aquaculture Models

ZHANG Wan-rong，XU Han-ying, ZHANG Xue-shu*et al

(Zhejiang Ocean University ，Zhoushan, Zhejiang 316022)

[Objective] The research aimed to provide theoretical basis for the scientific breeding ofLitopennausvannameiin high-elevation breeding pond. [Method] Selecting high-elevation breeding pond ofL.vannameiunder two different breeding models as test objects, the number of bacteria, the number of vibrio, the change laws of the ratio of other strains of vibrio to Vibrio parahaemolyticus and its correlation with the incidence of early mortality syndrome were studied by periodic sampling of water. [Result] The number of vibrios in test shrimp pond in the early breeding stage was less, the number changes of vibrios was consistent to total number of bacteria. When the total number of bacteria was more than 2.5×104cfu/ml, the number of vibrios was above 1.5×103cfu/ml and the ratio of other strains of vibrio toV.parahaemolyticuswas 10∶1, early mortality syndrome easily occurred in the shrimp pond. [Conclusion] The research results could be used to the risk evaluation of shrimp’s healthy breeding.

Litopennausvannamei; Bacteria; Vibrio; Aquaculture model

張婉蓉(1994-)，女，浙江寧波人，本科生，專業(yè)：水產(chǎn)養(yǎng)殖。*通訊作者，高級工程師，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病研究。

2015-03-13

S 945.4+9

A

0517-6611(2015)11-120-03