陳德森 李 莉 吳勝英 彭吉霞 李賢玉

急性膝關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型是基礎(chǔ)藥理學(xué)及臨床疼痛研究較常用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?］。以往常采用醋酸皮下注射法復(fù)制急性膝關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，本實(shí)驗(yàn)采用弗氏完全佐劑法復(fù)制膝關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，其病理形態(tài)及病理生理學(xué)改變與臨床膝關(guān)節(jié)炎甚為相似，具有相似度極高的臨床及生化檢驗(yàn)特點(diǎn)，現(xiàn)就該動(dòng)物模型制作介紹如下［2］。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF 級(jí)Wistar 大鼠30 只，雌雄兼用，體質(zhì)量180 ～250 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供［SCXK(鄂)2011 -008］，飼養(yǎng)于屏障設(shè)施［SYXK(鄂)2011 -0031］。

2.藥品與試劑:生理鹽水、醋酸、弗氏完全佐劑(上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司)。

3.急性膝關(guān)節(jié)炎模型制備:采用數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為3 組(n=10):對(duì)照組、醋酸組、佐劑組。碘伏浸泡大鼠右足趾消毒，采用日本鬼頭康彥的造摸方法，將弗氏完全佐劑0.5ml 注人右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，于第1、3、7 天各注射1 次［3］。根據(jù)臨床上超疲勞容易提前出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病特點(diǎn)，每日強(qiáng)迫動(dòng)物活動(dòng)30min，14 天后出現(xiàn)以下與臨床急性膝關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)一致的癥狀即可確定大鼠急性膝關(guān)節(jié)炎模型造模成功:①關(guān)節(jié)及其周圍僵硬、活動(dòng)受限;②關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛、同時(shí)軟組織腫脹或積液;③發(fā)病的部位常見(jiàn)于膝、髖、踝等關(guān)節(jié)處;④關(guān)節(jié)積液檢查出現(xiàn)IL-1β 降低，HA 含量明顯升高;⑤關(guān)節(jié)病理切片鏡檢出現(xiàn)關(guān)節(jié)腔大量滲出液，軟骨表面粗糙，滑膜增生、粘連、肥厚等膝關(guān)節(jié)炎臨床病理學(xué)改變。對(duì)照組注射等量生理鹽水作對(duì)照，醋酸組注射97%醋酸0.5ml。注射后創(chuàng)口碘伏浸泡消毒1 周(每日1 次)以預(yù)防感染。參照文獻(xiàn)［4］于造模后7、14 天分別抽取膝關(guān)節(jié)腔積液測(cè)定積液白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、透明質(zhì)酸(HA)含量。

4.動(dòng)物一般狀況觀察:動(dòng)物的一般狀況觀察(包括自潔情況、攝食、飲水量、活動(dòng)等)，存活情況。

5.膝關(guān)節(jié)腫脹百分率的測(cè)定:于造模前及造模后7、14 天用玻璃容器排水法測(cè)量:先取直徑2cm 的30ml 量筒注入蒸餾水，液面與量筒最高處平齊，用10ml 注射器吸取量筒內(nèi)蒸餾水約5ml。于每只大鼠右膝關(guān)節(jié)做一標(biāo)記，然后把大鼠右足跖緩慢伸人量筒內(nèi)，使標(biāo)記與量筒最高處平齊。再用已吸入5ml水的注射器向量筒內(nèi)緩慢注入蒸餾水并使液面再次與最高處及大鼠膝關(guān)節(jié)標(biāo)記一致，讀取注射器內(nèi)剩余液體體積，即為大鼠的膝關(guān)節(jié)體積，重復(fù)3 次取平均值。并計(jì)算膝關(guān)節(jié)腫脹百公率:膝關(guān)節(jié)腫脹百分率(%)= (造模后容積- 造模前容積)/造模前容積×100%。

6.組織形態(tài)學(xué)檢查:14 天后處死大鼠，迅速取各組動(dòng)物膝關(guān)節(jié)滑膜標(biāo)本用10%中性甲醛固定，1 周后常規(guī)脫水，石臘包埋，切片經(jīng)HE 染色，光鏡下觀察組織形態(tài)。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，指標(biāo)的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間差異則采用Dunnett 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.大鼠一般情況的變化:對(duì)照組造模前及造模后7、14 天觀察，大鼠體毛有光澤，反應(yīng)敏捷，飲食正常，無(wú)死亡。醋酸組大鼠1 周后精神及自潔情況差，大鼠體毛發(fā)無(wú)光澤，醋酸刺激性太強(qiáng)引起動(dòng)物劇痛舔足，關(guān)節(jié)腫脹，卷縮，拒絕活動(dòng)，攝食及飲水量減少，無(wú)死亡，8 只大鼠造模成功，模型成功率為80%。佐儕組大鼠1 周后精神及自潔情況較醋酸組稍好，部分大鼠體毛無(wú)光澤，關(guān)節(jié)及其周圍僵硬、活動(dòng)受限，舔足，攝食及飲水量與正常大鼠無(wú)明顯差別，無(wú)死亡，10 只大鼠均造模成功，模型成功率為100%。

2.膝關(guān)節(jié)積液中IL-1β、HA 含量:由表1 可見(jiàn)，對(duì)照組IL -1β、HA 無(wú)明顯變化;醋酸組在造模后7天時(shí)測(cè)得IL-1β 小幅度升高、HA 含量有降低趨勢(shì)，第14 天IL-1β 明顯高于、HA 含量低于對(duì)照組(P ＜0.05);佐儕組在造模后7 天時(shí)IL-1β 即開始明顯升高，HA 含量明顯降低，第14 天測(cè)得IL-1β 升高達(dá)峰值、HA 含量大幅降低，與術(shù)前及醋酸組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，說(shuō)明弗氏完全佐劑能在更短時(shí)間促使炎性介質(zhì)IL -1β 大量分泌釋放，抑制關(guān)節(jié)保護(hù)介質(zhì)HA 的分泌，破壞HA 對(duì)關(guān)節(jié)面的保護(hù)屏障而造成膝關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)。弗氏完全佐劑組生化測(cè)定與臨床相符度高，表明弗氏完全佐劑能更好的復(fù)制急性膝關(guān)節(jié)炎。

表1 大鼠造模前及術(shù)后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)IL-1β 及HA 含量的變化(±s，n=10)

表1 大鼠造模前及術(shù)后膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)IL-1β 及HA 含量的變化(±s，n=10)

與對(duì)照組比較，* P ＜0.05;與造模前比較，#P ＜0.05;與醋酸組比較，ΔP ＜0.05

組別 IL-1β(ng/ml)HA(mg/L)造模前 術(shù)后7 天 術(shù)后14 天 造模前 術(shù)后7 天 術(shù)后14天2.07 ±0.04 2.07 ±0.03醋酸組 19.19 ±0.25 24.94 ±0.27 25.54 ±0.37* 1.91 ±0.01 1.77 ±0.05 1.04 ±0.02*佐儕組 20.04 ±0.31 34.57 ±0.41* #Δ 41.47 ±0.48* #Δ 1.97 ±0.05 0.94 ±0.02* #Δ 0.73 ±0.01* #Δ對(duì)照組 18.32 ±0.24 17.91 ±0.24 18.23 ±0.23 2.01 ±0.05

3.膝關(guān)節(jié)腫脹百分率對(duì)比情況:對(duì)照組在造模后第7、14 天后關(guān)節(jié)無(wú)腫脹現(xiàn)象;醋酸組及佐劑組膝關(guān)節(jié)均出現(xiàn)不同程度的腫脹，醋酸組第7、14 天后關(guān)節(jié)腫脹百分率分別為22. 07% ± 0. 05%、21. 97% ±0.24%;佐劑組分別為36.21% ±4.71%、39.34% ±3.98%;數(shù)據(jù)顯示佐劑組關(guān)節(jié)腫脹百分率高于醋酸組，其炎性反應(yīng)更加明顯(P ＜0.05)，說(shuō)明弗氏完全佐劑復(fù)制急性膝關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型更為成功(表2)。

表2 大鼠造模前及術(shù)后膝關(guān)節(jié)腫脹百分率(%)對(duì)比(±s，n=10)

表2 大鼠造模前及術(shù)后膝關(guān)節(jié)腫脹百分率(%)對(duì)比(±s，n=10)

與對(duì)照組比較，* P ＜0.05;與造模前比較，#P ＜0.05;與醋酸組比較，ΔP ＜0.05

項(xiàng)目 造模前術(shù)后7 天 14天0.02 ±0.00 -0.01 ±0.00 0.01 ±0.01醋酸組 -0.01 ±0.01 22.07 ±0.05* 21.97 ±0.24*佐儕組 0.01 ±0.00 36.21 ±4.71* #Δ 39.34 ±3.98* #Δ對(duì)照組

4.膝關(guān)節(jié)滑膜病理切片組織形態(tài)學(xué)檢查:對(duì)照組(圖1A)組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)充血、水腫和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。醋酸組(圖1B)滑膜呈現(xiàn)充血、水腫和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。而佐劑組(圖1C)關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，變暗呈灰黃色，并有裂紋、糜爛及潰瘍形成;滑膜存在不同程度增生、粘連;關(guān)節(jié)液量增多，且呈泡沫狀，滑膜血管擴(kuò)張，血漿和細(xì)胞外滲，產(chǎn)生大量滲出液，滑膜肥厚、關(guān)節(jié)內(nèi)粘連和淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn);軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，基質(zhì)分布不均，表明弗氏完全佐劑致膝關(guān)節(jié)炎性反炎更為明顯。

圖1 14 天大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)觀察(HE，×40)

討 論

膝蓋滑膜炎又稱膝關(guān)節(jié)滑膜炎，是一種多發(fā)性疾?。?，6］。當(dāng)膝蓋滑膜損傷后，關(guān)節(jié)腔滑膜血管擴(kuò)張、充血、水腫及大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，造成關(guān)節(jié)腫脹及活動(dòng)受限［7］。如不及時(shí)處理，會(huì)導(dǎo)致滑膜絨毛水腫、結(jié)締組織纖維增生老化，造成滑膜組織再生及修復(fù)能力降低，嚴(yán)重者出現(xiàn)滑膜肥厚、關(guān)節(jié)粘連和軟骨變性等病理改變，嚴(yán)重影響患者活動(dòng)。故對(duì)膝關(guān)節(jié)滑膜炎的早期診治顯得尤為重要。本研究的目的就是為尋找一種病理形態(tài)及病理生理學(xué)改變與臨床膝關(guān)節(jié)炎高度相似的動(dòng)物模型用于研究膝關(guān)節(jié)滑膜炎。

關(guān)節(jié)炎的病理變化主要為軟骨的破壞與變性，以及繼發(fā)的滑膜與滑液炎性改變，是軟骨分解與合成代謝失衡的結(jié)果。正常的關(guān)節(jié)滑液中僅含有微量的IL-1β，但在膝關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中IL -1β 的含量則異常增高［8］。IL-1β 作為重要的炎性介質(zhì)，具有細(xì)胞破壞能力。王慶甫等［9］證明關(guān)節(jié)軟骨的破壞主要是由IL-1β 激發(fā)的。HA 是由D -葡萄糖醛酸和N -乙酰氨基葡萄糖胺二糖單位有規(guī)律重復(fù)構(gòu)成的大分子鏈狀多糖，化學(xué)本質(zhì)為糖胺多糖，廣泛分布于人及動(dòng)物的結(jié)締組織、眼玻璃體和滑液中，是關(guān)節(jié)滑液和軟骨基質(zhì)的重要組成部分，黏附于關(guān)節(jié)軟骨表面，形成保護(hù)屏障，調(diào)整滑膜通透性，減低摩擦系數(shù)潤(rùn)滑關(guān)節(jié)腔，營(yíng)養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨，利于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，醋酸組在造模后第14 天測(cè)得IL -1β 明顯升高、HA 含量降低，說(shuō)明炎性介質(zhì)分泌較晚;而弗氏完全佐劑組在造模后7 天即開始明顯升高，HA 含量明顯降低，第14 天測(cè)得IL-1β 升高達(dá)峰值、HA 含量顯著降低，與醋酸組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明弗氏完全佐劑能在更短時(shí)間內(nèi)促使炎性介質(zhì)IL-1β 大量分泌，抑制關(guān)節(jié)保護(hù)介質(zhì)HA 的分泌，破壞HA 對(duì)關(guān)節(jié)面的保護(hù)屏障而造成膝關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)。在造模后第7、14 天時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)，醋酸組及弗氏完全佐劑均發(fā)生關(guān)節(jié)腫脹，但弗氏完全佐劑組膝關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)更明顯，第7、14 天兩次測(cè)得膝關(guān)節(jié)腫脹百分率明顯大于醋酸組，其模型成功率達(dá)100%，明顯優(yōu)于醋酸組的80%。

在膝關(guān)節(jié)滑膜病理切片組織形態(tài)學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)，弗氏完全佐劑組病理學(xué)改變較醋酸組更為嚴(yán)重，出現(xiàn)典型的膝關(guān)節(jié)炎臨床病理學(xué)改變，如關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，基質(zhì)分布不均;關(guān)節(jié)表面粗糙，伴有裂紋、糜爛及潰瘍形成;滑膜存在不同程度增生、粘連;關(guān)節(jié)腔大量滲出積液并呈泡沫狀，滑膜肥厚、關(guān)節(jié)內(nèi)粘連和淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。目前急性膝關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型大多采用關(guān)節(jié)腔注射醋酸法，但其缺點(diǎn)是醋酸刺激性太強(qiáng)，會(huì)引起動(dòng)物劇痛，不太符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理及動(dòng)物福利規(guī)范，且其IL-1β、HA 分泌釋放改變比弗氏完全佐劑法出現(xiàn)的晚，病理改變亦不如弗氏完全佐劑典型［11］。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射弗氏完全佐劑第7 天后IL -1β 釋放即明顯升高、HA 顯著降低，具有典型的膝關(guān)節(jié)炎臨床病理學(xué)改變，且這種病理改變較醋酸組更為明顯，模型成功率高，IL-1β、HA 分泌改變出現(xiàn)早，動(dòng)物疼痛幅度低，更符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理及動(dòng)物福利規(guī)范要求，不失為一種較理想可靠的急性膝關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型造模方法［12］。

1 施新猷.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2000:464 -465

2 Gomes RP，Bressan E，Silva TM，et al.Effects of one minute and ten minutes of walking activity in rats with arthritis induced by complete Freund's adjuvant on pain and edema symptoms［J］. Rev Bras Reumatol，2014，54(2):83 -89

3 張曉軼，節(jié)曉光，張雅麗，等.“CHK”術(shù)式對(duì)兔膝OA 中SOD、MDA及NO 水平的影響［J］.貴州醫(yī)藥，2008 32(8):680 -684

4 Wang Z，Qiu Y，Lu Ji，et al.Connective tissue growth factor promotes interleukin-1β-mediated synovial inflammation in knee osteoarthritis［J］.Mol Med Rep，2013，8(3):877 -882

5 趙志華，李曉杰，胡書海，等.不同表面處理方法對(duì)纖維樁與牙本質(zhì)之間粘接強(qiáng)度的影響［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，2(2):125-129

6 黃蔚霞. 藥物對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型IL -1、IL -6 的影響［J］. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2002，3(6):124

7 錢伯初，史紅，鄭曉亮，等.尿酸鈉結(jié)晶誘導(dǎo)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型研究進(jìn)展［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18(6):65 -67

8 國(guó)延軍，牟成林.祛瘀通痹湯對(duì)原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎白細(xì)胞介素一1β 亞型及前列腺素E2 含量的影響［J］. 河北中醫(yī)，2010，32(2):257 -258

9 王慶甫，馬玉峰，殷岳衫，等.低頻超聲促透中藥對(duì)兔膝關(guān)節(jié)炎細(xì)胞因子的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36(2):108 -109

10 Bruyere SS.Glucosamine sulphate in the treatment of knee ostcoarthritis:cost - effectiveness comparison with paracetamol［J］. Int J Clin Pract，2010，64(6):756 -762

11 張建紅，劉田福，武東梅，等. 生物醫(yī)學(xué)研究中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利問(wèn)題［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志，2001，11(1):62 -64

12 楊國(guó)斌.生物醫(yī)學(xué)研究中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)問(wèn)題的思考［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)，2010，23(3):10 -13