王艷杰 阿不來(lái)海提 張宏偉 吳向未 馮文磊 張 猛

嚙齒類動(dòng)物因體積小、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和可控性好、且成本低廉而成為科學(xué)研究中最為廣泛使用的動(dòng)物模型［1］。Micro-CT，又稱微型CT 或小動(dòng)物CT，具有微米級(jí)的分辨率。它以較低的輻射劑量和高質(zhì)量的容積測(cè)量影像及定量分析功能，為小動(dòng)物成像研究提供解決方案，在臨床前生物醫(yī)學(xué)無(wú)創(chuàng)成像方面得到廣泛應(yīng)用［2，3］。Micro -CT 對(duì)一些疾病模型(如腫瘤模型、包蟲(chóng)病模型等)的研究，很多情況下要?jiǎng)討B(tài)觀察模型的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，這就需要保證小動(dòng)物存活。掃描前，先將造影劑經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，尾靜脈穿刺成功與否很大程度上決定實(shí)驗(yàn)?zāi)芊袢〉美硐氲慕Y(jié)果。由于Micro-CT 專業(yè)造影劑價(jià)格較為昂貴，筆者嘗試使用性價(jià)比較高的醫(yī)用碘海醇造影劑，如何提高圖像采集成功率及降低小鼠死亡率。在參照有關(guān)小鼠尾靜脈穿刺實(shí)踐的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步改進(jìn)穿刺設(shè)備及操作技術(shù)，運(yùn)用于小鼠Micro - CT 腹部增強(qiáng)造影中，取得了良好效果。

對(duì)象與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:健康昆明(KM)小鼠100 只，雌雄不限，6 ～8 周，體重20 ±2g，由石河子大學(xué)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為5 組，每組20 只。應(yīng)用5 組設(shè)備行尾靜脈穿刺:①常規(guī)1ml 注射器及2.5#諾和銳針頭;②常規(guī)1ml 注射器及4.5#針頭;③常規(guī)輸液器7#針頭;④常規(guī)輸液器5#針頭;⑤改良4.5#針頭及輸液連接裝置(圖1)。

圖1 各種型號(hào)注射器實(shí)物圖

2.材料和器材:skyscan1176 Micro-CT 活體成像系統(tǒng)［美國(guó)布魯克(Bruker)公司］;PHD 22/2000 微量精密注射泵(美國(guó)Harvard 公司，精度為0.0001μl/h);VMR 小動(dòng)物麻醉機(jī)［美國(guó)馬特(Matrx)公司］;異氟烷、普通醫(yī)用碘海醇造影劑、常規(guī)1ml 注射器及2.5#諾和銳針頭、常規(guī)1ml 注射器及4.5#針頭、常規(guī)輸液器7#針頭、常規(guī)輸液器5#針頭、改良4.5#針頭及輸液連接器、75%乙醇、0.9%氯化鈉溶液(250 毫升/瓶)均由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供。

3 改良注射器針頭并高壓滅菌后使用:將諾和銳2.5#針芯熱嫁接到4.5#針頭輸液器的輸液枕上，使輸液器的7#和5#針頭變?yōu)?.5#針頭(圖1e)。

4.圖像采集過(guò)程:(1)尾靜脈擴(kuò)張:首先對(duì)小鼠尾部行備皮處理，之后將小鼠固定，僅尾部顯露，鼠尾浸泡于50℃左右的溫水中約2min，用酒精棉球擦拭尾部，以擴(kuò)張尾靜脈［4］。(2)操作方法:小鼠行Micro-CT 掃描前需禁食8h，禁水4h，以減小腹部氣體干擾。使用3.4%異氟烷在麻醉?yè)]發(fā)罐中使小鼠麻醉，調(diào)節(jié)合適的刻度，時(shí)刻觀察小鼠生命體征，避免麻醉過(guò)度，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中麻醉維持流量為300ml/min。待麻醉滿意后，實(shí)驗(yàn)者將小鼠固定于Micro-CT 掃描床上，使用膠帶將小鼠四肢和胸部固定，要求松緊度適宜。同時(shí)由助手調(diào)整小鼠位置，使一側(cè)面小鼠尾靜脈朝向正上方。穿刺部位選擇尾部中下1/2 ～2/3 處。左手壓住小鼠尾部遠(yuǎn)端，右手持針頭，從選擇的靜脈正上方平行進(jìn)針，利用可機(jī)械化設(shè)置泵入時(shí)間及劑量的微量注射泵持續(xù)注入約0.3ml 造影劑(無(wú)此設(shè)備可使用其他方式代替)，穿刺成功后用輸液貼牢固地固定在掃描床邊緣。(3)圖像采集:5 組穿刺設(shè)備經(jīng)尾靜脈注入碘海醇造影劑，利用Micro-CT 行增強(qiáng)造影掃描，獲得掃描圖像經(jīng)系統(tǒng)軟件進(jìn)行圖像重建，觀察重建圖像能否出現(xiàn)增強(qiáng)期。如圖2 所示。(4)止血:分別行以上5 組操作后，操作者用左手拇指壓住注射針頭，撤離注射器，交由另一人用紗布?jí)鹤〈┐滩课环凑畚膊窟M(jìn)行止血。(5)記錄:記錄穿刺過(guò)程中5 組設(shè)備的穿刺成功次數(shù)和掃描后小鼠死亡數(shù)目。

圖2 注入碘海醇造影劑和不同設(shè)備穿刺后采集的圖像

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較選用卡方檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，各種型號(hào)的注射器優(yōu)缺點(diǎn)如下:①使用2.5#諾和銳針頭的注射器，尾靜脈注射成功率高，但不能在行CT 時(shí)持續(xù)泵入造影劑，另由于針體較短，固定時(shí)容易脫出;②常規(guī)1ml 注射器及4.5#針頭，穿刺成功率較2.5#針頭低，不能在行CT 時(shí)持續(xù)泵入造影劑;③常規(guī)輸液器7#針頭，穿刺成功率較4.5#針頭低;④常規(guī)輸液器5#針頭，穿刺成功率較7#針頭高，但較4.5#較低;⑤改良4.5#針頭及輸液連接裝置，穿刺成功率高，在微量注射泵的配合下，可實(shí)現(xiàn)造影劑精準(zhǔn)、持續(xù)的泵入且無(wú)人員暴露于輻射下，目前為最優(yōu)配置。采用前4 組穿刺時(shí)，經(jīng)尾靜脈注射的造影劑很快便經(jīng)過(guò)腎臟進(jìn)行代謝，導(dǎo)致增強(qiáng)造影效果不明顯。采用第5 組改良的方式進(jìn)行小鼠尾靜脈注射可以方便控制造影劑的出入量和速度，提高了穿刺的成功率和效率，同時(shí)達(dá)到了良好的造影效果。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，各組間尾靜脈穿刺成功率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.000，P =0.003)，圖像采集成功率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.429，P=0.009)，小鼠死亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.905，P =0.018)。其中第1 組穿刺成功率最高為95%，圖像采集成功率最低為42.10%，小鼠死亡率為30%;第2組穿刺成功率為80%，圖像采集成功率為43.75%，小鼠死亡率為50%;第3 組穿刺成功率最低為50%，圖像采集成功率為50.00%，小鼠死亡率為45%;第4組穿刺成功率為60%，圖像采集成功率為58.33%，小鼠死亡率為15%;第5 組穿刺成功率為90%，圖像采集成功率最高為94. 44%，小鼠死亡率最低為10%;綜合評(píng)價(jià)各組穿刺成功率、圖像采集率以及小鼠死亡率:第1 組穿刺成功率最高(95%)，但圖像采集率偏低，小鼠死亡率為30%(6 只);第4 組小鼠死亡率較低為15%(3 只)，但穿刺成功率和圖像采集率也較低;第5 組經(jīng)改良的穿刺設(shè)備，穿刺成功率較高(90%)，同時(shí)圖像采集率達(dá)最高(94.44%)，小鼠死亡率僅為10%(2 只)，同時(shí)可以控制注射速度和劑量，就避免了一次性大劑量注射動(dòng)物不能耐受的情況，有效控制了小鼠的死亡(圖3)。

討 論

適宜的環(huán)境溫度對(duì)尾靜脈擴(kuò)張有一定影響，應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度在28℃左右，特別是在新疆維吾爾族自治區(qū)，在冬季較寒冷條件下，適宜的溫度能夠使血流通暢，降低穿刺阻力，另外應(yīng)用熱水浴浸泡法也可以使尾靜脈擴(kuò)張［5］。在進(jìn)行穿刺時(shí)，可以通過(guò)回抽血來(lái)判斷穿刺是否成功。使用改良組穿刺設(shè)備，穿刺后也較易固定，即使小鼠稍微活動(dòng)也不會(huì)影響穿刺效果，在持針?lè)绞缴?，操作者用左手壓住小鼠尾部遠(yuǎn)端向下壓低稍傾斜，右手持針，斜面向上，從選擇的靜脈正上方平行進(jìn)針，針尖緊貼皮下刺入血管后再進(jìn)針約5mm，感覺(jué)無(wú)阻力后，稍回撤針見(jiàn)有回血，再輕推無(wú)阻力即可注射。在操作過(guò)程中，要避免采用其他不規(guī)范手式持針在針頭扎入血管后又換手帶來(lái)的針頭位移問(wèn)題。

圖3 不同穿刺設(shè)備的尾靜脈穿刺成功率(%)、小鼠死亡率(%)、圖像采集成功率(%)

一些科研工作者在進(jìn)行Micro -CT 腹部臟器增強(qiáng)造影實(shí)驗(yàn)中，時(shí)常會(huì)涉及經(jīng)小鼠尾靜脈注射造影劑的問(wèn)題。小鼠在正常生理體位下，尾部血管有4 根明顯可見(jiàn)，即背腹面上各有一根動(dòng)脈，兩個(gè)側(cè)面各有一根靜脈，平均直徑小于0.6 ±0.5mm［6］。通常情況下尾靜脈注射有著起效快，血藥濃度高等優(yōu)勢(shì)，但由于小鼠尾靜脈較細(xì)，穿刺困難而限制了其使用［7，8］。另一方面，Micro -CT 增強(qiáng)成像使用的專用造影劑Microfil［9］、Aurovist - gold nanoparticle angiographic agent、Fenestra LC/VC 等，注入小鼠體內(nèi)后可在相應(yīng)臟器部位停留數(shù)小時(shí)，能夠滿足單次注射增強(qiáng)掃描，但價(jià)格較為昂貴，比普通醫(yī)用造影劑要高幾十倍以上［10，11］。小鼠尾靜脈單次注射碘海醇造影劑的劑量一般不宜超過(guò)0.4ml，如果大劑量迅速推注，會(huì)容易造成小鼠超負(fù)載性猝死，特別是注射混懸型或高濃度造影劑時(shí)，更容易造成并發(fā)血管栓塞性猝死，所以應(yīng)盡量控制好注射劑量和速度。筆者在實(shí)驗(yàn)中常采用的注射劑量為0.3ml，盡管如此，前4 組方式注射后有部分小鼠出現(xiàn)呼吸急促、窒息和心臟驟停等猝死現(xiàn)象，可能與造影劑進(jìn)入太快，而導(dǎo)致的造影劑超載性猝死。若劑量過(guò)小，達(dá)不到造影效果，應(yīng)盡量使劑量和造影效果均衡。使用正確的注射器規(guī)格也很重要，有研究者使用1ml 注射器以及2ml 和2.5ml 注射器也取得了一定的實(shí)驗(yàn)成果［12，13］。筆者也發(fā)現(xiàn)1ml 注射器的4.5#針頭在尾靜脈穿刺中有較好的成功率，而在小鼠Micro-CT 增強(qiáng)造影實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)上述方法也存在弊端，如不能持續(xù)將造影劑以小劑量緩慢按時(shí)間-劑量需要，送入鼠體，會(huì)導(dǎo)致圖像采集失敗。因此筆者采用的是改良4.5#針頭及輸液連接裝置，配合微量注射泵，將造影劑持續(xù)泵入。

雖然Micro-CT 掃描時(shí)輻射劑量較低，但積累到一定程度同樣對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成身體損害，碘海醇在小鼠體內(nèi)代謝快，如果使用人工持續(xù)不斷地將0.3ml 的造影劑推入鼠體會(huì)導(dǎo)致以下問(wèn)題:①進(jìn)入鼠體造影劑劑量不精確;②時(shí)間不易掌握;③CT 掃描時(shí)，輻射對(duì)實(shí)驗(yàn)人員身體損害大。利用微量注射泵，可以程序化設(shè)定注射時(shí)間以及造影劑注射的速率和劑量，這樣就可以避免實(shí)驗(yàn)人員暴露于輻射源下。

經(jīng)過(guò)改良的設(shè)備進(jìn)行小鼠尾靜脈注射，穿刺成功率、圖像采集率和小鼠死亡率均有優(yōu)化，與其余組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這種改良的穿刺方式，使得Micro-CT 掃描的基于碘海醇的腹部增強(qiáng)造影效果得到提升，降低了科研成本，這對(duì)于后續(xù)進(jìn)行Micro -CT 增強(qiáng)造影的實(shí)驗(yàn)研究廣泛開(kāi)展提供非常必要的幫助。

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