褚娜利 張新華 方素萍 程艷玲 王文娟 吳志奎

地中海貧血是先天性基因缺陷致使人體不能正常合成血紅蛋白珠蛋白引起的一種遺傳性血液病，也叫珠蛋白合成障礙性貧血［1］。地中海貧血由于血紅蛋白珠蛋白基因缺陷而導(dǎo)致肽鏈?zhǔn)Ш?，使得過剩的珠蛋白肽鏈沉積于紅細(xì)胞膜，出現(xiàn)免疫損傷，誘發(fā)氧自由基反應(yīng)，繼發(fā)性酶和代謝異常，導(dǎo)致紅細(xì)胞變形和機(jī)械穩(wěn)定性下降，最終導(dǎo)致溶血和無效造血，引起一系列臨床綜合征［2］。最近研究發(fā)現(xiàn)，地中海貧血患者在不同的季節(jié)病情的嚴(yán)重程度不同，夏季溶血嚴(yán)重，冬季有所緩解，地中海貧血嚴(yán)重程度與季節(jié)變化有關(guān)［3，4］。為進(jìn)一步證實(shí)地中海貧血患者在氣溫高的季節(jié)( 夏季) 比氣溫低的季節(jié)( 冬季) 溶血貧血嚴(yán)重，并探討證候季節(jié)變化的生物學(xué)機(jī)制，吳志奎課題組于夏季(7 月份) 和冬季( 11 月份) 對11 例地中海貧血患者，觀察冬夏兩個月份地中海貧血患者血液參數(shù)和中醫(yī)證候量化評分水平的差異，并檢測冬夏兩個月份紅細(xì)胞溶血貧血相關(guān)指標(biāo)水平差異，初步探討地中海貧血患者證候季節(jié)變化的生物學(xué)機(jī)制，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

1.診斷標(biāo)準(zhǔn)：西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)按照張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中地中海貧血的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。中醫(yī)辨證診斷標(biāo)準(zhǔn)及辨證標(biāo)參照《中西醫(yī)臨床血液病學(xué)》和《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》［5～7］。

2.病例納入、排除標(biāo)準(zhǔn)： 病例納入標(biāo)準(zhǔn)： ①符合中間型地中海貧血西醫(yī)診斷者；②符合中醫(yī)肝腎陰虛、精血不足證辯證標(biāo)準(zhǔn)者；③年齡3 ～40 歲。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴免疫缺陷，肝、腎及血液系統(tǒng)其他原發(fā)性疾病者；②妊娠婦女；③近2 個月內(nèi)服用其他抗貧血藥者。

3.一般資料：11 例中間型地中海貧血患者(5 例α -地中海貧血、6 例β-地中海貧血) 均為就診于中國人民解放軍第303 醫(yī)院的門診病例。11 例地中海貧血患者男性7 例，女性5例；患者年齡9 ～26 歲，平均年齡14.73 ±5.87 歲；壯族7 例，漢族4 例。11 例地中海貧血患者的籍貫均為廣西籍。

4.觀察指標(biāo)與方法：(1) 主要血液參數(shù)的檢測：檢測冬夏11 例地中海貧血患者血液參數(shù)［血紅蛋白( Hb) 、紅細(xì)胞( RBC) 、網(wǎng)織紅細(xì)胞( Ret) ］的水平。(2) 中醫(yī)證候量化評分：觀察冬夏11 例患者的中醫(yī)證候( 頭暈?zāi)垦！⒆咨?、倦怠乏力、食少納呆、潮熱盜汗、腰酸腿軟) 并按課題組制定的《中醫(yī)證候量化評分表》進(jìn)行中醫(yī)證候量化評分［8］。(3) 外周血細(xì)胞因子活性的檢測：檢測冬夏11 例患者血清中造血細(xì)胞因子包括干細(xì)胞因子( SCF) 、白細(xì)胞介素-3( IL -3) 的含量。采用欣博盛公司ELISA 試劑盒檢測SCF、IL -3［SCF( EHC153.96) 批號：H140311 -53a；IL-3( EHC005.96) 批號：H140218 -13b］的含量；采用華美生物公司human EPO 試劑盒檢測EPO［EPO( 貨號： CSB - E04538H) 批號： C0302200354］的含量。(4) 紅細(xì)胞抗氧化損傷水平的檢測：檢測冬夏11 例患者紅細(xì)胞中抗氧化損傷指標(biāo)包括超氧化物歧化酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 、谷胱甘肽過氧化物酶( GSH -Px) 的含量。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的超氧化物歧化酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 、谷胱甘肽過氧化物酶( GSH-Px) 試劑盒［SOD( A001-3) 批號：20140321； MDA( A003 -1) 批號：20140321； GSH -Px( A005) ；批號：20140321］。(5) 紅細(xì)胞膜骨架蛋白的檢測：檢測冬夏11 例患者紅細(xì)胞膜骨架蛋白α - 收縮蛋白( SPTA1) 、β-收縮蛋白( SPTB) 、帶4.1 蛋白( EPB4.1) 的表達(dá)差異，用RNeasy Mini Kit( 50) 試劑盒( lot. no. 145039452、145047200) 提取單核細(xì)胞中的mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin 為內(nèi)參；引物有北京賽百盛生物科技有限公司合成，PCR 引 物 序 列 為： β- actin： 上 游 引 物： 5' - GAGACCTTCAACACCCCAGCC - 3'，下 游 引 物： 5' - AATGTCACGCACGATTTCCC-3'； SPTA1： 上游引物：5' - GATCTTGAAGCCAATGTCCA-3'，下游引物：5' -CAACTCCCTCCACTGGTG -3'；SPTB：上游引物：5' -AACCGGGATAAGGTCTTGAGTC-3'，下游引物：5' -GGTGCTTTAGCCATTTATTGTGA -3'；EPB4.1：上游引物：5' -TTATCCACTCACTCACCCTTCC-3'，下游引物：5' - CTCACTAGCAATCTCGGTCTCC - 3'； PCR 產(chǎn) 物 的 檢 測：1.2%瓊脂糖電泳，溴化乙錠( EB) 染色法檢測。檢測條件：電壓100V，擴(kuò)增產(chǎn)物在紫外燈下觀察，呈紅棕色熒光帶。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s) 表示，比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.11 例地中海貧血患者冬夏兩季血液參數(shù)水平比較：表1 示，冬季(11 月份) 地中海貧血患者Hb 水平顯著高于夏季(7 月份) ( P ＜0.05) ，RBC、Ret 冬夏兩個月份水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0.05) 。

表1 11 例地中海貧血患者冬夏兩季血液參數(shù)水平比較(±s)

表1 11 例地中海貧血患者冬夏兩季血液參數(shù)水平比較(±s)

與夏季比較，* P ＜0.05

時間 n Hb ( g/L) RBC ( ×1012/L) Ret ( %)11 79.17 ±9.72 3.94 ±0.97 5.36 ±2.92冬季 11 87.83 ±12.10*夏季4.03 ±0.85 4.26 ±0.85

2.11 例地中海貧血患者冬夏兩季中醫(yī)證候量化評分水平的比較：表2 示，冬季(11 月份) 地中海貧血患者爪甲色淡、食少納呆、潮熱盜汗的中醫(yī)證候量化評分顯著低于夏季( 7 月份) ( P ＜0.05) ； 頭暈?zāi)垦?、倦怠乏力、腰膝酸軟中醫(yī)證候量化評分冬夏兩個月份比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0.05) 。

表2 11 例地中海貧血患者冬夏兩季中醫(yī)證候量化評分水平比較(±s)

表2 11 例地中海貧血患者冬夏兩季中醫(yī)證候量化評分水平比較(±s)

與夏季比較，* P ＜0.05

時間 頭暈?zāi)垦?爪甲色淡 倦怠乏力 食少納呆 潮熱盜汗 腰酸腿軟夏季 0.58 ±1.16 3.08 ±2.47 2.09 ±2.34 2.09 ±2.17 4.0 0 ±3.19 0.64 ±1.43冬季 0.50 ±0.52 2.17 ±1.34* 1.64 ±2.20 0.91 ±1.45* 1.18 ±1.47*0.55 ±1.21

3.11 例地中海貧血患者冬夏兩季抗氧化損傷水平的比較：表3 示，冬季(11 月份) 紅細(xì)胞抗氧化損傷指標(biāo)SOD、GSH-Px 活性顯著低于夏季( 7 月份) ( P＜0.01) ，MDA 的活性顯著高于夏季( 7 月份) ( P ＜0.01) 。

表3 11 例地中海貧血患者冬夏兩季紅細(xì)胞抗氧化損傷水平(±s)

表3 11 例地中海貧血患者冬夏兩季紅細(xì)胞抗氧化損傷水平(±s)

與夏季比較，* P ＜0.01

時間 n SOD( U/gHb) MDA ( nmol/mg) GSH-Px ( U/gHb)11 7347.42 ±402.29 1.29 ±0.39 192.52 ±7.82冬季 11 5248.37 ±546.11* 2.55 ±0.74* 161.33 ±15.54夏季*

4.11 例地中海貧血患者冬夏兩季造血相關(guān)細(xì)胞因子水平比較：表4 示，冬季(11 月份) 血清造血細(xì)胞因子SCF、EPO 水平顯著高于夏季(7 月份) ( P ＜0.01或P ＜0.05) ，IL-3 活性水平冬季( 11 月份) 顯著低于夏季(7 月份) ( P ＜0.05) 。

表4 11 例地中海貧血患者冬夏兩季造血相關(guān)細(xì)胞因子水平比較(±s)

表4 11 例地中海貧血患者冬夏兩季造血相關(guān)細(xì)胞因子水平比較(±s)

與夏季比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

時間 n SCF( pg/ml) IL-3( pg/ml) EPO( mIU/ml)11 56.78 ±8.69 64.11 ±19.39 3.72 ±1.61冬季 11 65.69 ±4.67＊＊ 47.55 ±8.54* 5.31 ±0.89夏季*

5.11 例地中海貧血患者冬夏兩季紅細(xì)胞膜骨架蛋白表達(dá)水平比較：表5 示，冬季(11 月份) 地中海貧血患者紅細(xì)胞膜骨架蛋白SPTA1 mRNA 的表達(dá)水平顯著高于夏季(7 月份) ( P ＜0.05)，SPTB、EPB4.1 冬夏兩個月份的mRNA 的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

表5 11 例地中海貧血患者冬夏兩季紅細(xì)胞膜骨架蛋白表達(dá)水平比較(±s)

表5 11 例地中海貧血患者冬夏兩季紅細(xì)胞膜骨架蛋白表達(dá)水平比較(±s)

Ct 值為熒光檢測的域值與基因的表達(dá)量呈反比，與夏季比較，* P＜0.05

時間 n SPTA1/β-actin( Ct)SPTB/β-actin( Ct)EPB4.1/β-actin( Ct)11 2.18 ±0.30 1.88 ±0.21 1.82 ±0.19冬季 11 1.95 ±0.32*夏季1.80 ±0.25 1.68 ±0.25

討 論

地中海貧血( thalassaemia) 也叫珠蛋白生成障礙性貧血，是世界范圍內(nèi)發(fā)生率高、危害最大的單基因遺傳病。最近研究發(fā)現(xiàn)，地中海貧血患者在不同的季節(jié)病情的嚴(yán)重程度不同，夏季溶血嚴(yán)重，冬季有所緩解，地中海貧血病情嚴(yán)重程度與季節(jié)變化有關(guān)。2006年吳志奎等［9］在廣西高發(fā)區(qū)對112 例中間型地中海貧血患者進(jìn)行了中醫(yī)證候量化評分、辨證分型，發(fā)現(xiàn)中間型地中海貧血患者病情嚴(yán)重程度與季節(jié)變化有關(guān)，其證候變化特點(diǎn)是：基本證型未變，但臨床癥狀有明顯的季節(jié)改變( 夏季肝腎陰虛加重： 頭暈?zāi)垦?、潮熱盜汗耳鳴、惡熱等癥狀明顯加重) 。

2012 年吳志奎課題組在廣西高發(fā)區(qū)在夏季(7 月份) 和冬季(11 月份) 分別收集HbH 病患者31 例和35 例，進(jìn)一步觀察地中海貧血患者證候季節(jié)變化的客觀規(guī)律，研究發(fā)現(xiàn)影響地中海貧血患者主要癥狀的血液參數(shù)Hb 水平，冬季組HbH 病患者顯著高于夏季，冬季組HbH 病患者大多數(shù)中醫(yī)證候如面色萎黃、爪甲色淡、耳鳴、口咽干燥的量化評分顯著低于夏季組，說明患者夏季比冬季病情嚴(yán)重，與冬夏兩組患者臨床血液參數(shù)水平結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了HbH 病患者病情嚴(yán)重程度存在季節(jié)變化。地中海貧血患者的證候季節(jié)變化體現(xiàn)了中醫(yī)“天人合一”四時陰陽的整體觀。地中海貧血患者血液參數(shù)的季節(jié)改變、溶血貧血嚴(yán)重程度的季節(jié)變化，影響患者臨床中醫(yī)證候特異性組合的改變，這種證候的季節(jié)變化可能與一些和溶血相關(guān)的生物大分子的活性、表達(dá)、代謝及紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能等相關(guān)的生物標(biāo)志物群的季節(jié)性改變有關(guān)。有研究顯示地中海貧血患者夏季病情嚴(yán)重的機(jī)制可能為夏季高溫天氣下，血容量增加導(dǎo)致內(nèi)源性血液稀釋［10］。但季節(jié)性氣溫變化對地中海貧血患者臨床癥狀影響的程度和血液參數(shù)呈現(xiàn)季節(jié)性變化的生物學(xué)機(jī)制到底是什么，目前仍鮮有報道。本研究擬從季節(jié)對地中海貧血患者紅細(xì)胞溶血貧血影響的角度探討證候季節(jié)變化的生物學(xué)機(jī)制，從一個側(cè)面揭示地中海貧血證候季節(jié)變化的生物學(xué)機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，影響地中海貧血患者主要癥狀的血液參數(shù)Hb 水平，冬季( 11 月份) 地中海貧血患者Hb 水平顯著高于夏季( 7 月份) 。通過對冬夏兩組患者中醫(yī)證候量化評分，發(fā)現(xiàn)冬季(11 月份) 地中海貧血患者大多數(shù)中醫(yī)證候如爪甲色淡、食少納呆、潮熱盜汗的量化評分顯著低于夏季，說明患者夏季比冬季病情嚴(yán)重，與冬夏兩個時間節(jié)點(diǎn)主要的臨床血液參數(shù)Hb 水平結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了地中海貧血患者病情嚴(yán)重程度存在季節(jié)變化。地中海貧血患者溶血貧血的一個重要原因是紅細(xì)胞對氧化損傷非常敏感［11］。

MDA 是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷的生物標(biāo)志物［12］。SOD 和GSH -Px 是機(jī)體抵抗氧化損傷的重要物質(zhì)［13，14］。Dhawan 等［13］研究β -地中海貧血純合子患者抗氧化損傷狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)患者SOD 活性與Hb水平呈負(fù)相關(guān)，說明隨著患者病情嚴(yán)重程度加重SOD水平代償性的升高。Filiz 等［15］研究發(fā)現(xiàn)地中海貧血患者SOD 和GSH -Px 活性與正常人相比升高，認(rèn)為是機(jī)體的代償機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，冬季( 11 月份) 紅細(xì)胞抗氧化損傷指標(biāo)SOD、GSH - Px 活性顯著低于夏季( 7 月份) ，MDA 的活性顯著高于夏季( 7 月份) ，患者機(jī)體由于SOD、GSH-Px 的代償作用使得夏季( 7 月份) MDA的含量低于冬季(11 月份) ，說明夏季患者病情嚴(yán)重程度比冬季重，激發(fā)患者代償作用清除體內(nèi)過多的氧化產(chǎn)物。相對過剩的珠蛋白鏈沉積在紅細(xì)胞膜上，與紅細(xì)胞膜結(jié)合，可改變膜蛋白的組成，干擾膜骨架蛋白與膜的聯(lián)結(jié)，導(dǎo)致變形能力下降； 誘發(fā)膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致連接膜骨架的膜蛋白發(fā)生氧化損傷，從而造成紅細(xì)胞膜機(jī)械穩(wěn)定性下降等。研究發(fā)現(xiàn)，冬季(11 月份) 地中海貧血患者紅細(xì)胞膜骨架蛋白SPTA1 mRNA 的表達(dá)水平顯著高于夏季( 7 月份) ，SPTA1、SPTB、EPB4.1 對維持紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)非常重要，初步推斷地中海貧血患者夏季比冬季溶血貧血嚴(yán)重的原因之一可能與兩個季節(jié)患者紅細(xì)胞膜骨架蛋白表達(dá)不同有關(guān)。SCF 是一類刺激早期造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞增殖和定居的造血生長因子，IL -3 為造血調(diào)控因子，也為一種炎性因子。EPO 它可以促進(jìn)紅細(xì)胞的生成，使血液中紅細(xì)胞的濃度保持在一個較高的水平。本研究發(fā)現(xiàn)冬季( 11 月份) 血清造血細(xì)胞因子SCF、EPO 水平顯著高于夏季(7 月份) ，IL -3 活性水平冬季(11 月份) 顯著低于夏季( 7 月份) ，推斷地中海貧血患者夏季比冬季溶血貧血嚴(yán)重的原因之一可能與兩個季節(jié)患者體內(nèi)與造血相關(guān)細(xì)胞因子活性不同有關(guān)。

本研究進(jìn)一步證實(shí)了地中海貧血患者病情嚴(yán)重程度存在季節(jié)變化的客觀規(guī)律，并從與地中海貧血患者紅細(xì)胞溶血貧血的幾個側(cè)面初步闡釋了地中海貧血患者冬夏兩季病情嚴(yán)重程度不同的生物學(xué)機(jī)制，仍需要開展進(jìn)一步的臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。

1 吳志奎. 中醫(yī)藥對邊遠(yuǎn)民族地區(qū)人口與健康的貢獻(xiàn)： 益髓生血治療地中海貧血取得重大進(jìn)展［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2008，4(11) ：4 -8

2 鐘永，張錦.地中海貧血的溶血機(jī)制［J］. 國外醫(yī)學(xué)：兒科學(xué)分冊，1995，22(4) ：172 -174

3 Lau P，Hansen M，Sererat M. Influence of climate on donor daeferrals［J］.Transfusion，1988，28(6) ：559 -562

4 張新華，吳志奎，羅瑞貴，等. 中間型地中海貧血患者血紅蛋白和紅細(xì)胞壓積的季節(jié)性變化［J］.臨床血液雜志，2007，20(6) ：371 -372

5 張之南.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：科學(xué)出版社，2007：33

6 劉峰，麻柔. 中西醫(yī)臨床血液病學(xué)［M］. 北京： 中國中醫(yī)藥出版社，1998：197 -202

7 鄭筱萸. 中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則［M］. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社，1993：91 -99

8 王文娟，劉文軍，吳志奎，等. 中間型地中海貧血患者中醫(yī)證候分布規(guī)律研究［J］.中醫(yī)雜志，2007，48(8) ：726 -729

9 吳志奎，張新華，李敏，等.益髓生血顆粒治療β-地中海貧血156例臨床觀察［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26 (4) ：352 -354

10 Borgna-Pignatti C，Ventola M，F(xiàn)riedmanman D，et al. Seasonal variation of pretransfusion hemoglobin levels in patient s with thalassemia major［J］.Blood，2006，107(1) ：355 -357

11 Rachmilewitz EA，Lubin BH，Shohet SB. Lipid peroxidation in beta-thalassemia major［J］. Blood，1976，47(3) ：495 -505

12 Handan D，Duran C，Güchan A，et al.The antioxidant effects of capparis ovata and deferasirox in patients with thalassemia major［J］.Blood Disorders Transf，2013，4(3) ：2155 -2159

13 Dhawan V，Kumar KR，Marwaha RK，et al.Antioxidant status in children with homozygous β - thalassemia［J］. Iindian Pediatrics，2005，42(17) ：1141 -1145

14 Klaudia J，Marian V.Advances in metal-induced oxidative stress and human disease［J］.Toxicology，2011，283(2 -3) ：365 -387

15 Filiz S，Gulyuz O，Sabri K，et al.“Oxidant and antioxidant status in beta thalassemia major patients”［J］. Ankara University Faculty of Medicine，2005，58(1) ：34 -38