王碧琴 周華 朱祺 劉騰云 余發(fā)新

摘要：以紫山藥的莖尖、莖段為材料，對(duì)莖尖、莖段誘導(dǎo)分化不定芽進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明，莖尖、莖段不定芽的分化率隨6-BA濃度的增加而提高，芽苗增殖率先由低到高，再降低；MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.1mg/L培養(yǎng)基對(duì)不定芽有較高的分化率和增殖率；莖尖、莖段培養(yǎng)20d為1個(gè)繼代周期，莖段在第2次繼代期、莖尖在第3次繼代周期培養(yǎng)時(shí)，不定芽的增殖率最高；不定芽苗2.0～3.0cm時(shí)從苗基部或分枝處剪下進(jìn)行生根誘導(dǎo)，生根率在95%以上。

關(guān)鍵詞：紫山藥；莖尖；莖段；組織培養(yǎng)；不定芽

中圖分類號(hào)：S632.104+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0048-03

紫山藥俗稱薯蕷、腳板薯、長(zhǎng)芋，為薯蕷科薯蕷屬（Dioscorea）的一個(gè)地方品種，為多年生蔓性植物，塊根呈塊狀或圓柱狀，表皮和肉質(zhì)因呈紫紅色而得名。紫山藥肥大的肉質(zhì)塊根細(xì)膩滑爽、口感極佳，富含黏性蛋白、紫色花青素、維生素、膽堿和薯蕷皂（天然的DHEA）等，內(nèi)含各種荷爾蒙基本物質(zhì)，有促進(jìn)內(nèi)分泌荷爾蒙的合成等多種獨(dú)特食療價(jià)值，也稱“紫人參”。據(jù)《本草綱目》記載，經(jīng)常食用紫山藥，不僅可以增加人體的抵抗力，降低血壓、血糖，抗衰益壽等，而且還具有固腎、潤(rùn)肺益精、軟化血管等藥用滋補(bǔ)功能，故又享有“蔬菜之王”的美譽(yù)。病毒病是造成山藥產(chǎn)量下降、品質(zhì)退化的重要因素。紫山藥由于長(zhǎng)期使用塊莖繁殖，出現(xiàn)病毒積累，種性退化，已危及到產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)量，不但滿足不了市場(chǎng)需求，還嚴(yán)重影響和制約地方產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和種植的積極性。山藥感染的主要病毒有壞死花葉病毒、綠色斑駁病毒、馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒[1]，目前尚無(wú)有效藥物可控制這些病毒病的發(fā)生或蔓延。采用現(xiàn)代生物技術(shù)，選取優(yōu)良無(wú)病株種苗進(jìn)行離體脫毒培養(yǎng)，以組培苗更替?zhèn)鹘y(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)繁殖可以從根本上解決病毒病的問(wèn)題。有關(guān)盾葉薯蕷、惠樓山藥、懷山藥等組織培養(yǎng)與快繁的研究[2-5]已見(jiàn)報(bào)道，紫山藥組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究還末見(jiàn)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)開(kāi)展紫山藥組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究，以期為紫山藥組培苗工廠化生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

紫山藥，由江西萬(wàn)載輝明有機(jī)農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司提供。選擇個(gè)大無(wú)病蟲(chóng)、表面根毛少、肉紫色的塊莖，經(jīng)表面消毒，在室（棚）溫15～25℃于盆中沙藏催芽30d左右，待嫩芽生長(zhǎng)到20～30cm即可作為外植體取材。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基初始培養(yǎng)基：MS；誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基：MS+6-BA0.1～2.0mg/L+NAA0.1mg/L；生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L+Ac0.2g/L。所用培養(yǎng)基均含45g/L食用糖和瓊脂6g/L，pH值為5.8。培養(yǎng)基在121℃、131kPa條件下滅菌25min，備用。

1.2.2外植體消毒去掉展開(kāi)的葉片，分別剪成帶葉柄的莖段、莖尖；用洗液清洗干凈，在無(wú)菌操作臺(tái)上用70%乙醇消毒30s，無(wú)菌水沖洗數(shù)次；分別用0.1%HgCl2浸泡消毒，莖尖5min、莖段10min，用無(wú)菌水沖洗數(shù)次。

1.2.3莖尖和莖段的初始培養(yǎng)莖段帶節(jié)剪成0.8～1.0cm的小段，共72段，莖尖剪留0.5～0.8cm，共30個(gè)；分別接種于初始培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)枯死率和成活率。

1.2.4激素濃度對(duì)莖尖、莖段的誘導(dǎo)分化初始培養(yǎng)的莖段腋芽抽長(zhǎng)2.0cm時(shí)，將新抽枝從基部剪下，每莖段0.5cm左右，帶葉柄接種在不同激素濃度的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，每處理接種30莖段；初始培養(yǎng)的莖尖修剪基部褐化的部分，取莖尖0.3cm左右，接種在不同激素濃度的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，每處理接種12莖尖。莖尖、莖段培養(yǎng)20d，新鮮培養(yǎng)基繼代1次，40d后觀察不定芽變化，并統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)分化率、不定芽數(shù)和增殖率。

1.2.5培養(yǎng)周期對(duì)莖尖、莖段的誘導(dǎo)分化再生莖尖、莖段（含不同株系紫山藥1#、2#）各30個(gè)，接種在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，每培養(yǎng)20d為1個(gè)繼代周期，共繼代4次，統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)和增殖率。

1.2.6生根培養(yǎng)剪取不定芽苗2.0～3.0cm，接種于生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，20d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)。

1.3培養(yǎng)條件

接種后的試材，均在溫度（25±2）℃、光照度1200lx、光照時(shí)間10h/d條件下培養(yǎng)。

2結(jié)果與分析

2.1莖尖、莖段的初始培養(yǎng)

外植體接種在初始培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3d，基部開(kāi)始變褐，培養(yǎng)基出現(xiàn)褐化，褐色物滲入培養(yǎng)基呈圓形；培養(yǎng)10～15d，外植體基部褐化加重，部分莖尖變褐、枯死，莖段基部1/3處枯死；培養(yǎng)20d，莖尖枯死率為17%，莖段枯死率為7%，外植體基部的莖節(jié)處腫大，并有淡紅色圓形芽點(diǎn)，莖段葉柄張開(kāi)，腋芽開(kāi)始萌動(dòng)；培養(yǎng)30d左右，莖段葉腋抽生1～2個(gè)不定芽，長(zhǎng)0.5～2.5cm，稍嫩的莖段葉腋形成0.1～0.2cm小瘤狀物，莖尖、莖段成活率分別為43%和91%。

2.26-BA濃度對(duì)莖尖、莖段誘導(dǎo)分化的影響

莖尖0.3cm、莖段0.5cm分別接種在不同6-BA濃度的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3～5d，莖段切口處分泌褐色物，在培養(yǎng)基中擴(kuò)散由淺褐至深褐；培養(yǎng)10～15d，莖段基部增粗，葉柄張開(kāi)，腋芽萌發(fā)單個(gè)或多個(gè)不定芽小點(diǎn)，單個(gè)不定芽伸長(zhǎng)，生長(zhǎng)較快，不定根長(zhǎng)2～4cm，不定芽長(zhǎng)2.0cm，隨激素濃度的加大，莖段形成的叢生芽體數(shù)增多，最多可達(dá)5～7個(gè)，莖尖由于個(gè)體小，分化的芽點(diǎn)也小，分化率雖高，但能形成正常的小芽少，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，部分小芽可生長(zhǎng)成正常芽，但芽體較弱、矮小或畸型；培養(yǎng)20d左右，不定芽基部生長(zhǎng)1～3條淡紅色不定根，不定根生長(zhǎng)快，可直接伸入培養(yǎng)基分泌酚類化合物，受多酚氧化酶激活產(chǎn)生醌類物質(zhì)，加重培養(yǎng)基褐化程度。由表1可見(jiàn)，6-BA濃度為0.1mg/L時(shí)，莖尖、莖段誘導(dǎo)分化率和增殖率均最低，分別為90%、0%和93%、123%；6-BA濃度為1.0mg/L時(shí)，莖尖、莖段誘導(dǎo)增殖率均為[KG*5]最高，分別為50%和250%；莖尖和莖段在MS+6-BA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，既能保持一定的分化率又有較好的不定芽增殖率。

2.3培養(yǎng)周期對(duì)莖尖、莖段誘導(dǎo)分化的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，莖段培養(yǎng)15～20d，不定芽由莖段基部葉腋、隱芽分化，或由腋芽直接分化形成不定芽，莖尖僅在葉腋處膨大，露出小小的芽點(diǎn)；培養(yǎng)40d（2次繼代），莖段不定芽長(zhǎng)0.5～1.0cm，不定芽增殖數(shù)達(dá)到高峰，增殖數(shù)達(dá)到42個(gè)，后不定芽增殖系數(shù)逐步下降；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，不定芽增多，形成多個(gè)多芽體（圖1），莖節(jié)處有少量不定根；培養(yǎng)60d（第3次繼代），莖段苗高2.0～4.0cm，基部1～2節(jié)處有多條不定根，并有多芽體叢生現(xiàn)象，基部不定芽分化基本停止，莖稈節(jié)腋處產(chǎn)生重疊多芽體，芽體莖稈細(xì)小，不利于作次代增殖材料，莖尖葉腋形成多個(gè)不定芽，增殖數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)不定芽增多，增殖數(shù)由少到高并回落，莖尖培養(yǎng)60d時(shí)不定芽增殖數(shù)為最高，增殖數(shù)達(dá)到40個(gè)（表2）；隨著培養(yǎng)繼代次數(shù)的增加，不定芽增殖數(shù)增加，出現(xiàn)枝上生芽的多芽體現(xiàn)象。

2.4對(duì)不同株系莖段誘導(dǎo)分化的影響

紫山藥不同株系從試管苗外觀上進(jìn)行區(qū)別，1#莖稈粗壯、淡綠色，葉片綠色，2#莖稈稍細(xì)、紫色，葉深紫色（圖2、圖3）。在培養(yǎng)過(guò)程中，紫山藥1#莖段愈傷組織較松軟，誘導(dǎo)不定芽時(shí)間短，需7～10d，產(chǎn)生不定芽2～3個(gè)，且生長(zhǎng)伸長(zhǎng)快，容易形成多芽體現(xiàn)象；紫山藥2#愈傷莖段組織質(zhì)地較硬，誘導(dǎo)不定芽時(shí)間長(zhǎng)，需15～20d，不定芽為單個(gè)生長(zhǎng)，伸長(zhǎng)慢，芽體小，增殖系數(shù)也少（表3）。紫山藥1#芽體每繼代周期的增殖系數(shù)是紫山藥2#的1.54倍，有利于建立快繁體系。這種不同的誘導(dǎo)分化效果，與材料本身的生理遺傳基因-植物受體多樣性及與內(nèi)源激素的合成和代謝差異有密切關(guān)系[6-9]。

2.5不定芽的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)

由圖4可見(jiàn)，在生根培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10d，小苗基部開(kāi)始著生1～3條白或水紅色細(xì)長(zhǎng)的根，15d后根在培養(yǎng)基底部長(zhǎng)達(dá)10cm；小苗葉片大，色質(zhì)光綠，葉柄長(zhǎng)，小苗主側(cè)枝伸長(zhǎng)，莖節(jié)上不斷有不定根形成。20d后生根率在95%以上，此時(shí)，可移出培養(yǎng)室，在自然光下煉苗3～5d，用水洗凈瓊脂，移栽至營(yíng)養(yǎng)缽。

3小結(jié)

紫山藥外植體接種后由自養(yǎng)變?yōu)楫愷B(yǎng)，細(xì)胞代謝發(fā)生變化，產(chǎn)生了一些酚類化合物，這些酚類物質(zhì)受多酚氧化酶激活，被氧化后產(chǎn)生呈粽褐色的醌類物質(zhì)，隨著外植體的傷口或愈傷組織逐步從組織擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，影響外植體器官的分化，嚴(yán)重時(shí)會(huì)使組織死亡。莖尖組織比較幼嫩，抗醌類物質(zhì)毒害較弱，在培養(yǎng)過(guò)程中容易褐化死亡。因此，外植體在接種后需釆用7～10d繼代（更換）1次培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基中高濃度激素是加劇外植體褐變的因素。在次生莖段分化增殖培養(yǎng)中，當(dāng)6-BA濃度為1.0～2.0mg/L時(shí)褐化較重，每15d左右就需繼代1次培養(yǎng)基；當(dāng)6-BA0.5mg/L時(shí)褐化較輕，一般20～25d更換1次培養(yǎng)基有利于細(xì)胞的正常分化。在一定范圍內(nèi)，激素濃度與次生莖段誘導(dǎo)分化率成正比，激素濃度越高，分化的不定芽越多。培養(yǎng)繼代的次數(shù)越多，產(chǎn)生不定芽多芽體也多，尤其在不定芽2次繼代后比較明顯，這與晏嬰才等的研究結(jié)論[2]基本相似。

從不定芽增殖量上看，外植體莖尖誘導(dǎo)分化的不定芽數(shù)量多于莖段。從生物遺傳角度及農(nóng)藝性狀上分析，莖尖誘導(dǎo)分化的不定芽變異性大，對(duì)改良品種、選育新品種比較適合，莖段快繁能保持品種的品性，有利于提高品種的優(yōu)良品質(zhì)。因此，在利用組織培養(yǎng)技術(shù)時(shí)，應(yīng)根據(jù)需求目的，選擇適合的培養(yǎng)方式來(lái)建立無(wú)性快繁體系。

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