董曉婭+邱白晶+管賢平

摘要：基于氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制乙酰膽堿酯酶活性的原理，以硫化鎘-石墨烯納米復(fù)合物為酶固定化材料，以西維因作為模型化合物構(gòu)建了基于乙酰膽堿酯酶的氨基甲酸酯類農(nóng)藥的生物傳感平臺(tái)。結(jié)果表明，固定在硫化鎘-石墨烯納米復(fù)合材料上的乙酰膽堿酯酶與氯化硫代乙酰膽堿的親和能力強(qiáng)，并且硫化鎘-石墨烯納米復(fù)合材料上的乙酰膽堿酯酶對(duì)氯化硫代乙酰膽堿的催化活性高，其米氏常數(shù)Km為0.24mmol；由于硫化鎘-石墨烯納米復(fù)合材料的引入，增加了氯化硫代乙酰膽堿在電極表面的電子轉(zhuǎn)移速度，提高了檢測(cè)的靈敏度；該傳感器對(duì)西維因的檢測(cè)范圍為2ng/mL～2μg/mL，檢測(cè)限為0.72ng/mL，研究結(jié)果為氨基甲酸酯類農(nóng)藥的快速檢測(cè)提供了一種有效的途徑。

關(guān)鍵詞：黃瓜；西維因；農(nóng)藥殘留；電化學(xué)方法；生物傳感平臺(tái)

中圖分類號(hào)：TQ450.2+63文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0337-02

農(nóng)藥在保護(hù)農(nóng)作物、防治病蟲(chóng)草害、改善人類生存環(huán)境、控制疾病等方面發(fā)揮了巨大作用，因而農(nóng)藥的使用給人們帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，對(duì)人類生存起到了重要作用。但是隨著農(nóng)藥使用范圍的逐漸擴(kuò)大和使用量的不斷增加，逐漸暴露了其作為污染物的不足以及由此造成的眾多環(huán)境及食物安全問(wèn)題[1]。近年來(lái)，氨基甲酸酯類農(nóng)藥的廣泛使用已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的健康以及環(huán)境和食品安全，并引起了社會(huì)的普遍關(guān)注，因此實(shí)現(xiàn)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的快速和靈敏檢測(cè)具有十分重要的意義[2]。

目前對(duì)農(nóng)藥中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)方法主要包括氣相色譜、高效液相色譜、薄層色譜、毛細(xì)管電泳、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、流動(dòng)注射分析法等。這些方法均存在樣品前處理復(fù)雜、儀器設(shè)備昂貴、分析費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、要求熟練的技術(shù)人員才能完成等問(wèn)題。因此，開(kāi)發(fā)靈敏度高、方便快捷、準(zhǔn)確安全、特異性強(qiáng)的檢測(cè)新技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行痕量檢測(cè)已成為迫在眉睫的重要研究課題之一。電化學(xué)檢測(cè)方法以其靈敏度高、速度快、花費(fèi)低、危害低等優(yōu)越性，已經(jīng)在諸多的測(cè)定技術(shù)中脫穎而出[3]，并廣泛應(yīng)用于環(huán)境、醫(yī)藥、食品發(fā)酵等領(lǐng)域。電化學(xué)分析的另一特點(diǎn)是儀器簡(jiǎn)單，不受體系濁度和顏色影響，其安培檢測(cè)信號(hào)與待測(cè)物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系，因而可將檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)換為直觀易讀的濃度值，便于非專業(yè)人士使用[4]。本試驗(yàn)采用電化學(xué)方法對(duì)黃瓜中西維因的殘留量進(jìn)行分析，該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可以適用于農(nóng)藥的快速檢測(cè)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2014年春季在江蘇大學(xué)玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行。

1.2試驗(yàn)材料

以新津春四F1為試驗(yàn)對(duì)象，在黃瓜開(kāi)花當(dāng)天，用西維因噴灑花朵，進(jìn)行正常田間管理。隨機(jī)摘取花后6、8、10d的黃瓜，分別將其粉碎，各個(gè)樣品隨機(jī)稱取20g并分別放入取樣瓶中，加入30mL丙酮?jiǎng)×艺饎?dòng)混勻，離心5min后取上清液，經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干，加入100mL磷酸鹽緩沖液（PBS）。

西維因標(biāo)準(zhǔn)品、乙酰膽堿酯酶、氯化硫代乙酰膽堿，購(gòu)于Sigma-Aldrich試劑公司；西維因水劑，購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

KQ-100型超聲波清洗器，購(gòu)于昆山市超聲儀器有限公司；JB-1型攪拌器，購(gòu)于上海雷磁儀器廠新涇分廠；ZENNIUM電化學(xué)工作站，購(gòu)于德國(guó)Zahner公司；H1650離心機(jī)，購(gòu)于湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3硫化鎘-石墨烯納米復(fù)合物的合成

通過(guò)改進(jìn)的Hummers法[5]合成氧化石墨，以氧化石墨和硝酸鎘為原料、以硫化氫為硫源和還原劑制備硫化鎘-石墨烯納米復(fù)合物。具體制備方法為：稱取170mg所制得氧化石墨，將其加入到含有100mL蒸餾水的反應(yīng)瓶中，超聲30min；在磁力攪拌下向該懸浮液中緩慢加入500mL0.02mol/L硝酸鎘溶液，常溫下攪拌3h；然后向反應(yīng)瓶中通入硫化氫氣體，反應(yīng)1h后將其離心分離，將所得納米材料干燥后備用。

1.4修飾電極的構(gòu)建

將直徑為3.0mm的玻碳電極在使用前依次用1.0、0.3μm的三氧化二鋁拋光粉在拋光布上拋成鏡面，然后在無(wú)水乙醇中超聲清洗1min，再用雙蒸水超聲清洗1min，用氮?dú)獯蹈呻姌O后在其表面滴涂5μL2mg/mL的硫化鎘-石墨烯納米復(fù)合物，室溫晾干后將修飾的電極浸入含有10U/mL乙酰膽堿酯酶的0.1mol/LPBS（pH值7.4）中，置于4℃冰箱中10h，然后取出電極并清洗掉弱鍵合或弱吸附的酶分子，制成修飾電極。

1.5分析方法

電化學(xué)試驗(yàn)在德國(guó)ZENNIUM電化學(xué)工作站上進(jìn)行，采用傳統(tǒng)的三電極體系：修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為輔助電極。循環(huán)伏安技術(shù)檢測(cè)時(shí)，先將三電極體系插入含氯化硫代乙酰膽堿的PBS溶液中檢測(cè)電流信號(hào)，然后將工作電極取出，在含有多菌靈的溶液中浸泡2min，接著把工作電極放回電解池中檢測(cè)電流信號(hào)，根據(jù)電流前后的酶抑制效率，確定多菌靈的濃度。計(jì)時(shí)電流試驗(yàn)考察酶在電極上的活性時(shí)是在電磁攪拌下的PBS溶液中進(jìn)行的，待加上操作電壓，背景電流達(dá)到穩(wěn)定值后，用微量注射器迅速加入一定濃度的氯化硫代乙酰膽堿溶液到電解池中，以相應(yīng)的電流值作為氯化硫代乙酰膽堿的響應(yīng)信號(hào)。所有測(cè)量試驗(yàn)均在室溫25℃下進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1硫化鎘-石墨烯復(fù)合材料固定乙酰膽堿酯酶的酶催化活性

西維因?qū)σ阴Ｄ憠A酯酶的酶抑制效率用以下公式計(jì)算：

酶抑制效率=（1-Ip，exp/Ip，control）×100%。

式中：Ip，control為氯化硫代乙酰膽堿在工作電極上的響應(yīng)峰電流；Ip，exp為工作電極在酶被抑制后的響應(yīng)峰電流。

以恒電位計(jì)時(shí)電流法研究酶的催化活性。由圖1可以看出，隨著氯化硫代乙酰膽堿濃度的不斷增加，生物傳感器的電流響應(yīng)呈現(xiàn)出Michaelis-Menten特性，其表觀Michaelis-Menten常數(shù)Km（表示酶對(duì)底物的親和力）可由電化學(xué)Lineweaver-Burk方程[6]得到。由圖2數(shù)據(jù)分析可知，吸附態(tài)乙酰膽堿酯酶的Km值為0.24mmol/L，比文獻(xiàn)報(bào)道的吸附在納米金溶膠-凝膠膜（0.45mmol/L）[7]和碳納米管修飾膜（4.4mmol/L）[8]上乙酰膽堿酯酶的Km值小得多，說(shuō)明吸附在硫化鎘-石墨烯納米復(fù)合膜電極上的乙酰膽堿酯酶對(duì)催化底物氯化硫代乙酰膽堿具有較高的親和性和催化活性。endprint

2.2氨基甲酸酯類農(nóng)藥西維因檢測(cè)方法的可行性

在含有1mmol/L氯化硫代乙酰膽堿的PBS緩沖體系中作循環(huán)伏安曲線（圖3-a），然后將工作電極分別經(jīng)0.002、0.01、0.02、0.1μg/mL的西維因（圖3中分別標(biāo)為b、c、d、e）抑制2min后，在含有氯化硫代乙酰膽堿的溶液中作相應(yīng)的循環(huán)伏安曲線，發(fā)現(xiàn)其氧化峰電流逐漸降低，并且隨著西維因濃度的增大，其峰電流的降低值也增大，如圖3中曲線b、c、d、e所示，因而基于氨基甲酸酯農(nóng)藥西維因?qū)σ阴Ｄ憠A酯酶活性的抑制作用，可構(gòu)建一種簡(jiǎn)單、有效的用于氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測(cè)的電化學(xué)方法。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制不同濃度的西維因標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.5”節(jié)中的方法進(jìn)行操作，以修飾電極在西維因標(biāo)準(zhǔn)溶液中浸泡前后的酶抑制效率為縱坐標(biāo)，以西維因相應(yīng)濃度的對(duì)數(shù)lg（西維因濃度）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖4可見(jiàn)，兩者呈良好的線性關(guān)系，線性范圍為2ng/mL～2μg/mL，檢測(cè)限為0.72ng/mL。

2.4精密度測(cè)定

對(duì)同一樣品重復(fù)測(cè)定8次，測(cè)其精確度，發(fā)現(xiàn)對(duì)西維因的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.76%，表明該方法的精密度良好。

2.5準(zhǔn)確度測(cè)定

準(zhǔn)確取3份10mL西維因浸提液，分別加入一定含量的西維因標(biāo)準(zhǔn)品，按樣品測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，其結(jié)果見(jiàn)表1，可見(jiàn)檢測(cè)回收率在98.5%～101.3%之間。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度高，符合農(nóng)藥檢測(cè)要求。

2.6西維因在黃瓜中的殘留分析

分別于6、8、10d對(duì)花期經(jīng)過(guò)西維因處理過(guò)的黃瓜取樣，并進(jìn)行電化學(xué)分析，均未檢出西維因。

3結(jié)論

以硫化鎘-石墨烯納米復(fù)合物作為乙酰膽堿酯酶的固定化材料，基于氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)固定在硫化鎘-石墨烯納米復(fù)合物上乙酰膽堿酯酶的抑制作用，構(gòu)建了一種快速、靈敏的安培型氨基甲酸酯類農(nóng)藥的生物傳感器。結(jié)果表明，在2ng/mL～2μg/mL的范圍內(nèi)，乙酰膽堿酯酶的抑制率與西維因濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)下限可達(dá)0.72ng/mL，說(shuō)明該傳感器具有較高的精密度和準(zhǔn)確度。

參考文獻(xiàn)：

[1]伍小紅，李建科，惠偉.農(nóng)藥殘留對(duì)食品安全的影響及對(duì)策[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（6）：80-84.

[2]崔洪力，李強(qiáng)，劉美良.農(nóng)藥殘留及監(jiān)控對(duì)策[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2002，22（5）：74-76.

[3]SerraB，MoralesMD，ZhangJB，etal.In-a-dayelectrochemicaldetectionofcoliformsindrinkingwaterusingatyrosinasecompositebiosensor[J].AnalyticalChemistry，2005，77（24）：8115-8121.

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[7]DuD，ChenSZ，CaiJ，etal.ImmobilizationofacetylcholinesteraseonGoldnanoparticlesembeddedinsol-gelfilmforamperometricdetectionoforganophosphorousinsecticide[J].Biosensors&Bioelectronics，2007，23（1）：130-134.

[8]LeeCG，WeiXD，KysarJW，etal.Measurementoftheelasticpropertiesandintrinsicstrengthofmonolayergraphene[J].Science，2008，321（5887）：385-388.endprint

2.2氨基甲酸酯類農(nóng)藥西維因檢測(cè)方法的可行性

在含有1mmol/L氯化硫代乙酰膽堿的PBS緩沖體系中作循環(huán)伏安曲線（圖3-a），然后將工作電極分別經(jīng)0.002、0.01、0.02、0.1μg/mL的西維因（圖3中分別標(biāo)為b、c、d、e）抑制2min后，在含有氯化硫代乙酰膽堿的溶液中作相應(yīng)的循環(huán)伏安曲線，發(fā)現(xiàn)其氧化峰電流逐漸降低，并且隨著西維因濃度的增大，其峰電流的降低值也增大，如圖3中曲線b、c、d、e所示，因而基于氨基甲酸酯農(nóng)藥西維因?qū)σ阴Ｄ憠A酯酶活性的抑制作用，可構(gòu)建一種簡(jiǎn)單、有效的用于氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測(cè)的電化學(xué)方法。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制不同濃度的西維因標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.5”節(jié)中的方法進(jìn)行操作，以修飾電極在西維因標(biāo)準(zhǔn)溶液中浸泡前后的酶抑制效率為縱坐標(biāo)，以西維因相應(yīng)濃度的對(duì)數(shù)lg（西維因濃度）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖4可見(jiàn)，兩者呈良好的線性關(guān)系，線性范圍為2ng/mL～2μg/mL，檢測(cè)限為0.72ng/mL。

2.4精密度測(cè)定

對(duì)同一樣品重復(fù)測(cè)定8次，測(cè)其精確度，發(fā)現(xiàn)對(duì)西維因的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.76%，表明該方法的精密度良好。

2.5準(zhǔn)確度測(cè)定

準(zhǔn)確取3份10mL西維因浸提液，分別加入一定含量的西維因標(biāo)準(zhǔn)品，按樣品測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，其結(jié)果見(jiàn)表1，可見(jiàn)檢測(cè)回收率在98.5%～101.3%之間。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度高，符合農(nóng)藥檢測(cè)要求。

2.6西維因在黃瓜中的殘留分析

分別于6、8、10d對(duì)花期經(jīng)過(guò)西維因處理過(guò)的黃瓜取樣，并進(jìn)行電化學(xué)分析，均未檢出西維因。

3結(jié)論

以硫化鎘-石墨烯納米復(fù)合物作為乙酰膽堿酯酶的固定化材料，基于氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)固定在硫化鎘-石墨烯納米復(fù)合物上乙酰膽堿酯酶的抑制作用，構(gòu)建了一種快速、靈敏的安培型氨基甲酸酯類農(nóng)藥的生物傳感器。結(jié)果表明，在2ng/mL～2μg/mL的范圍內(nèi)，乙酰膽堿酯酶的抑制率與西維因濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)下限可達(dá)0.72ng/mL，說(shuō)明該傳感器具有較高的精密度和準(zhǔn)確度。

參考文獻(xiàn)：

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[3]SerraB，MoralesMD，ZhangJB，etal.In-a-dayelectrochemicaldetectionofcoliformsindrinkingwaterusingatyrosinasecompositebiosensor[J].AnalyticalChemistry，2005，77（24）：8115-8121.

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[7]DuD，ChenSZ，CaiJ，etal.ImmobilizationofacetylcholinesteraseonGoldnanoparticlesembeddedinsol-gelfilmforamperometricdetectionoforganophosphorousinsecticide[J].Biosensors&Bioelectronics，2007，23（1）：130-134.

[8]LeeCG，WeiXD，KysarJW，etal.Measurementoftheelasticpropertiesandintrinsicstrengthofmonolayergraphene[J].Science，2008，321（5887）：385-388.endprint

2.2氨基甲酸酯類農(nóng)藥西維因檢測(cè)方法的可行性

在含有1mmol/L氯化硫代乙酰膽堿的PBS緩沖體系中作循環(huán)伏安曲線（圖3-a），然后將工作電極分別經(jīng)0.002、0.01、0.02、0.1μg/mL的西維因（圖3中分別標(biāo)為b、c、d、e）抑制2min后，在含有氯化硫代乙酰膽堿的溶液中作相應(yīng)的循環(huán)伏安曲線，發(fā)現(xiàn)其氧化峰電流逐漸降低，并且隨著西維因濃度的增大，其峰電流的降低值也增大，如圖3中曲線b、c、d、e所示，因而基于氨基甲酸酯農(nóng)藥西維因?qū)σ阴Ｄ憠A酯酶活性的抑制作用，可構(gòu)建一種簡(jiǎn)單、有效的用于氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測(cè)的電化學(xué)方法。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制不同濃度的西維因標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.5”節(jié)中的方法進(jìn)行操作，以修飾電極在西維因標(biāo)準(zhǔn)溶液中浸泡前后的酶抑制效率為縱坐標(biāo)，以西維因相應(yīng)濃度的對(duì)數(shù)lg（西維因濃度）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖4可見(jiàn)，兩者呈良好的線性關(guān)系，線性范圍為2ng/mL～2μg/mL，檢測(cè)限為0.72ng/mL。

2.4精密度測(cè)定

對(duì)同一樣品重復(fù)測(cè)定8次，測(cè)其精確度，發(fā)現(xiàn)對(duì)西維因的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.76%，表明該方法的精密度良好。

2.5準(zhǔn)確度測(cè)定

準(zhǔn)確取3份10mL西維因浸提液，分別加入一定含量的西維因標(biāo)準(zhǔn)品，按樣品測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，其結(jié)果見(jiàn)表1，可見(jiàn)檢測(cè)回收率在98.5%～101.3%之間。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度高，符合農(nóng)藥檢測(cè)要求。

2.6西維因在黃瓜中的殘留分析

分別于6、8、10d對(duì)花期經(jīng)過(guò)西維因處理過(guò)的黃瓜取樣，并進(jìn)行電化學(xué)分析，均未檢出西維因。

3結(jié)論

以硫化鎘-石墨烯納米復(fù)合物作為乙酰膽堿酯酶的固定化材料，基于氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)固定在硫化鎘-石墨烯納米復(fù)合物上乙酰膽堿酯酶的抑制作用，構(gòu)建了一種快速、靈敏的安培型氨基甲酸酯類農(nóng)藥的生物傳感器。結(jié)果表明，在2ng/mL～2μg/mL的范圍內(nèi)，乙酰膽堿酯酶的抑制率與西維因濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)下限可達(dá)0.72ng/mL，說(shuō)明該傳感器具有較高的精密度和準(zhǔn)確度。

參考文獻(xiàn)：

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[8]LeeCG，WeiXD，KysarJW，etal.Measurementoftheelasticpropertiesandintrinsicstrengthofmonolayergraphene[J].Science，2008，321（5887）：385-388.endprint