王雷+崔震海+張立軍

摘要：以玉米自交系鄭58基因組DNA為模板，設(shè)計了2對特異性引物，分別PCR擴(kuò)增玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）啟動子及其全長編碼序列，利用In-Fusion技術(shù)將兩者定向克隆到載體pCAMBIA-1391Z上，并對重組子進(jìn)行測序驗證。結(jié)果表明，該PEPC啟動子序列與GenBank中的玉米自交系B73的同源性為97.70%，片段長1200bp；全長編碼序列同源性為97.90%，片段長6330bp。通過HindⅢ和EcoRⅠ酶切載體pCAMBIA-1391Z，利用In-Fusion技術(shù)將線性載體與之前獲得的2個PCR片段連接，測序結(jié)果與預(yù)期序列一致，表明成功構(gòu)建了pCAMBIA-1391Z-PEPC植物表達(dá)載體。對克隆和載體構(gòu)建中存在的問題進(jìn)行了討論，以期為該類型基因的高效克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建提供參考、為C4型PEPC基因功能研究和C3植物遺傳轉(zhuǎn)化提供可用的基因序列。

關(guān)鍵詞：玉米；PEPC；基因克??；序列分析；表達(dá)載體構(gòu)建

中圖分類號：Q786；S513.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0026-04

根據(jù)CO2固定初始產(chǎn)物的不同，可將高等植物分成C3、C4、CAM這3類。以三碳化合物3-磷酸甘油酸為最初光合產(chǎn)物的光合途徑為C3途徑（或卡爾文循環(huán)），以四碳化合物草酰乙酸為最初光合產(chǎn)物的光合途徑為C4途徑。C4途徑具有CO2濃縮機(jī)制，能高效利用大氣中的CO2，使植物保持較高的光合效率[1-3]，因此人們大量開展了將C3植物轉(zhuǎn)化為C4植物的研究，但是許多這類轉(zhuǎn)化沒有達(dá)到預(yù)期目的[4]。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）存在于所有能進(jìn)行光合作用的有機(jī)體中，包括植物、綠藻和光合細(xì)菌等。根據(jù)其序列特征和功能結(jié)構(gòu)，PEPC基因可劃分為C4、C3-1、C3-23個亞族，其中C4型主要在葉肉細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，并且受光照調(diào)控，C3-1型主要在黃色葉片、莖等部位表達(dá)，C3-2型主要在根部表達(dá)；C4型的PEPC基因由C3型PEPC基因進(jìn)化而來[5-7]。研究表明，將雜交玉米品種（GoldenCrossBantam）的C4型PEPC全長基因（包括自身的啟動子）轉(zhuǎn)入C3植物，PEPC酶活性提高了2～110倍，蘋果酸濃度也提高了，光合速率在強(qiáng)光條件下明顯提高。研究還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)玉米PEPC基因cDNA和水稻Cab啟動子的嵌合基因的水稻僅能使光合作用效率提高數(shù)倍，而將完整的玉米PEPC基因（包括外顯子、內(nèi)含子及自身的啟動子）轉(zhuǎn)入水稻中則能數(shù)十倍或更高地提高其光合效率[8-17]。這說明以嵌合基因形式轉(zhuǎn)化C3植物，即cDNA和組成型啟動子CaMV35S或光誘導(dǎo)型Cab啟動子，或采用C4全長基因和自身啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，對基因更好地表達(dá)和作用的發(fā)揮是十分必要的。

另外，C4關(guān)鍵酶基因由于序列較長，即使成功克隆，也不容易連入表達(dá)載體。在傳統(tǒng)載體構(gòu)建方法中，需要將基因的2個末端經(jīng)過酶切修飾后插入載體，不僅要尋找合適的酶切位點，而且操作復(fù)雜，通常還需要構(gòu)建多個中間載體，并進(jìn)行多次酶切連接轉(zhuǎn)化，工作量較大而且構(gòu)建效率較低，尤其不適合構(gòu)建長片段、多片段拼接的復(fù)雜載體。In-Fusion是近年來發(fā)展起來的高效率載體構(gòu)建技術(shù)，已應(yīng)用于多基因融合和長片段克隆等方面[18]，運用該技術(shù)進(jìn)行基因克隆和載體構(gòu)建時，不需要借助T4DNA連接酶和補(bǔ)平DNA片段末端等操作步驟，只是在PCR引物設(shè)計中分別引入載體酶切位點兩端的各15bp序列，在In-Fusion重組酶作用下將PCR產(chǎn)物和已經(jīng)線性化的載體連接起來，從而完成載體構(gòu)建。In-Fusion技術(shù)對目的片段和載體沒有特殊的要求，可以將任何目的基因連接到線性化載體上。

玉米的C4型PEPC基因序列較長，同時還需要連入啟動子，多片段連接表達(dá)載體存在困難。因此，本研究利用PCR技術(shù)擴(kuò)增玉米C4型PEPC全長編碼序列及其啟動子序列，結(jié)合In-Fusion技術(shù)一步成功構(gòu)建表達(dá)載體，并對克隆和載體構(gòu)建中存在的問題進(jìn)行討論，以期為該類型基因的高效克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建提供參考，進(jìn)而為C4型PEPC基因功能的研究和C3植物的遺傳轉(zhuǎn)化提供可用的基因序列。

1材料與方法

1.1植物材料、菌株和載體

玉米（ZeamaysL.）自交系鄭58、pCAMBIA-1391Z植物表達(dá)載體（圖1）由筆者所在實驗室保存，E.coliHST08Premium菌株購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2主要試劑

PrimeSTARGXLDNAPolymerase（CodeNo.R050Q）試劑盒、TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.3.0試劑盒（CodeNo.9762）、In-FusionHDCloningKit試劑盒、高效感受態(tài)細(xì)菌制備試劑盒E.coliCompetentCellsHST08Premium（CodeNo.9128）、各種限制性內(nèi)切酶、DNAmarker均購自寶生物工程（大連）有限公司；植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DP209）、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3引物設(shè)計

根據(jù)In-Fusion技術(shù)原理，利用NCBI上已經(jīng)發(fā)表的玉米C4光合關(guān)鍵酶PEPC基因全長DNA序列（GenBank號：CM000785.3）和表達(dá)載體pCAMBIA-1391Z，設(shè)計并合成PEPC基因啟動子及其全長編碼序列的引物，詳見表1。

1.4玉米C4型PEPC啟動子及其全長編碼序列的PCR擴(kuò)增

采用以上引物和PrimeSTARGXLDNAPolymerase（CodeNo.R050Q）試劑盒，以玉米自交系鄭58基因組DNA為模板，對PEPC基因啟動子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50μLPCR總反應(yīng)體系為：1μLDNA模板，10μL5×PrimeSTARGXLbuffer（Mg2+plus），4μLdNTPMixture（各2.5mmol/L），各0.5μL上下游引物（20pmol/μL），1μLPrimeSTARGXLDNAPolymerase（1.25U/μL），33μLddH2O。PCR擴(kuò)增程序為：98℃變性10s，60℃退火15s，68℃延伸1min，共進(jìn)行30個循環(huán)。同樣，對PEPC基因全長編碼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50μLPCR總反應(yīng)體系為：1μLDNA模板，10μL5×PrimeSTARGXLbuffer（含Mg2+），4μLdNTPMixture（各2.5mmol/L），各0.5μL上下游引物（20pmol/μL），1μLPrimeSTARGXLDNAPolymerase（1.25U/μL），33μLddH2O。PCR擴(kuò)增程序為：98℃變性10s，60℃退火15s，68℃延伸6min，共進(jìn)行30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后切下目的條帶，用膠回收試劑盒回收用于后續(xù)試驗。同時取PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.5植物表達(dá)載體的構(gòu)建

分別用HindⅢ、RcoRⅠ雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA-1391Z。50μL酶切反應(yīng)體系為：5μLpCAMBIA-1391Z，5μL10×Mbuffer，1.5μLHindⅢ（10U/μL），1.5μLEcoRⅠ（10U/μL），37μLddH2O，37℃完全酶切16h。用瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收目的片段，利用In-FusionHDCloningKit（ClontechCodeNo.639633）試劑盒將“1.4”節(jié)中經(jīng)過測序驗證正確并回收的PEPC基因全長編碼序列、PEPC基因啟動子片段和線性載體pCAMBIA-1391Z片段連接，連接反應(yīng)體系為：1μLPEPC基因擴(kuò)增回收片段（約80ng/μL），1μLPEPC基因啟動子擴(kuò)增回收片段（約80ng/μL），1μLpCAMBIA-1391Z酶切片段，2μL5×In-FusionHDEnzymePremix，5μLddH2O。取1μL連接產(chǎn)物，熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetentCellsHST08Premium中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆、提質(zhì)粒、測序驗證，所得載體命名為pCAMBIA-1391Z-PEPC。

2結(jié)果與分析

2.1玉米基因組DNA的提取

使用植物基因組DNA提取試劑盒提取的玉米基因組DNA，由圖2的0.8%瓊脂糖凝膠電泳與紫外檢測結(jié)果看出，D260nm/D280nm在1.8～2.0之間，表明模板質(zhì)量較高，符合后續(xù)試驗要求。

2.2玉米C4型PEPC啟動子及其全長編碼序列的克隆

2.2.1目的片段的獲得以玉米自交系鄭58葉片DNA為模板，通過PCR分別擴(kuò)增出2條大小約為1200bp（圖3）、6330bp的特異性條帶（圖4），利用瓊脂糖回收試劑盒（DP209）進(jìn)行膠回收并測序。

2.2.2PCR產(chǎn)物測序結(jié)果的比對通過BLAST將測序結(jié)果與玉米B73相關(guān)序列進(jìn)行比對，PEPC啟動子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與玉米B73PEPC啟動子的比對結(jié)果見圖5，經(jīng)分析相似度達(dá)到97.70%；PEPC基因全長編碼序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與玉米B73PEPC基因的比對結(jié)果見圖6，經(jīng)分析相似度達(dá)到97.90%。

由以上結(jié)果可以看出，試驗用的玉米自交系鄭58C4型PEPC基因及其啟動子序列與已注冊的玉米B73的序列相似度都在90%以上，可以用作后續(xù)載體構(gòu)建。

2.2.3PEPC基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建采用In-Fusion克隆技術(shù)，將載體pCAMBIA-1391Z經(jīng)HindⅢ/RcoRⅠ雙酶切，獲得的片段檢測結(jié)果見圖7，可見片段大小為11000bp。線性化載體pCAMBIA-1391Z、PEPC基因全長及其啟動子在In-FusionHDEnzymePremix作用下重組，成功獲得重組質(zhì)粒pCAMBIA-1391Z-PEPC。將重組質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetentCellsHST08Premium中，挑陽性克隆測序，結(jié)果表明，PEPC基因全長及其啟動子已經(jīng)成功插入到載體pCAMBIA-1391Z之中，測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致（圖8），表明成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA-1391Z-PEPC。

3討論與結(jié)論

植物表達(dá)載體的構(gòu)建在植物基因工程研究中占據(jù)重要地位，直接關(guān)系到目的基因的表達(dá)效果，因此選擇方便與快捷的載體構(gòu)建方法具有重要的意義。目前，人們已經(jīng)發(fā)明了多種表達(dá)載體構(gòu)建的方法，例如傳統(tǒng)酶切連接方法、一步克隆法、Gateway技術(shù)等[19-20]。在構(gòu)建表達(dá)載體過程中，首先需要對表達(dá)載體進(jìn)行選擇，常用的植物表達(dá)載體有pBI121、pBI221、pCAMBIA系列載體（載體的骨架是pUC18）。根據(jù)本試驗克隆的PEPC基因全長編碼序列及其啟動子，筆者選擇了沒有

啟動子序列的植物表達(dá)載體pCAMBIA-1391Z。多個目的片段插入植物表達(dá)載體常常受到酶切位點的限制，操作復(fù)雜，費時費力。與傳統(tǒng)的載體構(gòu)建方法相比，In-Fusion技術(shù)可以減少中間載體的構(gòu)建，減少連接、轉(zhuǎn)化次數(shù)，重組效率高；相對于Gateway技術(shù)來說，In-Fusion技術(shù)更簡單，更快速。本研究采用In-Fusion技術(shù)進(jìn)行目的片段克隆時，引物5′端設(shè)計與線性載體同源的15bp序列，通過PCR實現(xiàn)多目的片段與表達(dá)載體重組連接。試驗中分別用HindⅢ/EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，利用In-Fusion酶將線性載體與之前獲得的2個PCR片段連接，成功構(gòu)建pCAMBIA-1391Z-PEPC植物表達(dá)載體，測序結(jié)果與預(yù)期序列一致。

參考文獻(xiàn)：

[1]龔春梅，寧蓬勃，王根軒，等.C3和C4植物光合途徑的適應(yīng)性變化和進(jìn)化[J].植物生態(tài)學(xué)報，2009，33（1）：206-221.

[2]崔國瑞，張立軍，朱延姝，等.植物C4光合途徑的形成及其影響因素[J].植物生理學(xué)通訊，2009（7）：711-720.

[3]VonCaemmererS，F(xiàn)urbankRT.TheC4pathway：anefficientCO2pump[J].PhotosynthesisResearch，2003，77（2/3）：191-207.

[4]李衛(wèi)華，郝乃斌，戈巧英，等.C3植物中C4途徑的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報，1999，16（2）：2-11.

[5]MatsuokaM，F(xiàn)urbankRT，F(xiàn)ukayamaH，etal.MolecularengineeringofC4photosynthesis[J].AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology，2001，52（1）：297-314.

[6]EngelmannS，BlsingOE，GowikU，etal.MolecularevolutionofC4phosphoenolpyruvatecarboxylaseinthegenusFlaveria—agradualincreasefromC3toC4characteristics[J].Planta，2003，217（5）：717-725.

[7]BlsingOE，ErnstK，StreubelM，etal.Thenon-photosyntheticphosphoenolpyruvatecarboxylasesoftheC4dicotFlaveriatrinervia—implicationsfortheevolutionofC4photosynthesis[J].Planta，2002，215（3）：448-456.

[8]OsborneCP，SackL.EvolutionofC4plants：anewhypothesisforaninteractionofCO2andwaterrelationsmediatedbyplanthydraulics[J].PhilosophicalTransactionsoftheRoyalSocietyofLondon.SeriesB，BiologicalSciences，2012，367（1588）：583-600.

[9]陳緒清，張曉東，梁榮奇，等.玉米C4型pepc基因的分子克隆及其在小麥的轉(zhuǎn)基因研究[J].科學(xué)通報，2004，49（19）：1976-1982.

[10]HudspethRL，GrulaJW，DaiZ，etal.Expressionofmaizephosphoenolpyruvatecarboxylaseintransgenictobacco[J].PlantPhysiology，1992，98（2）：458-464.

[11]HuslerRE，HirschHJ，KreuzalerF，etal.OverexpressionofC4-cycleenzymesintransgenicC3plants：abiotechnologicalapproachtoimproveC3-photosynthesis[J].JournalofExperimentalBotany，2002，53（369）：591-607.

[12]AgarieS，MiuraA，SumikuraR，etal.OverexpressionofC4PEPCcausedO2-insensitivephotosynthesisintransgenicriceplants[J].PlantScience，2002，162（2）：257-265.

[13]MerkelbachS，GehlenJ，DeneckeM，etal.Cloning，sequenceanalysisandexpressionofacDNAencodingactivephosphoenolpyruvatecarboxylaseoftheC3plantSolanumtuberosum[J].PlantMolecularBiology，1993，23（4）：881-888.

[14]FukayamaH，TsuchidaH，AgarieS，etal.SignificantaccumulationofC4-specificpyruvate，orthophosphatedikinaseinaC3plant，rice[J].PlantPhysiology，2001，127（3）：1136-1146.

[15]FukayamaH，TamaiT，TaniguchiY，etal.Characterizationandfunctionalanalysisofphosphoenolpyruvatecarboxylasekinasegenesinrice[J].ThePlantJournal：forCellandMolecularBiology，2006，47（2）：258-268.

[16]BrownRH，BassettCL，CameronRG，etal.PhotosynthesisofF1hybridsbetweenC4andC3-C4speciesofflaveria[J].PlantPhysiology，1986，82（1）：211-217.

[17]AgarieS，KaiM，TakatsujiH，etal.ExpressionofC3andC4photosyntheticcharacteristicsintheamphibiousplantEleocharisvivipara：structureandanalysisoftheexpressionofisogenesforpyruvate，orthophosphatedikinase[J].PlantMolecularBiology，1997，34（2）：363-369.

[18]SleightSC，SauroHM.BioBrickTM：assemblyusingthein-fusionPCRcloningkit[J].MethodsinMolecularBiology，2013，1073：19-30.

[19]韓凱，翁建峰，郝轉(zhuǎn)芳，等.一種快速高效構(gòu)建植物表達(dá)載體的方法[J].玉米科學(xué)，2012，20（1）：61-66.

[20]林春晶，韋正乙，蔡勤安，等.幾種植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法[J].生物技術(shù)，2008，18（5）：84-87.

[7]BlsingOE，ErnstK，StreubelM，etal.Thenon-photosyntheticphosphoenolpyruvatecarboxylasesoftheC4dicotFlaveriatrinervia—implicationsfortheevolutionofC4photosynthesis[J].Planta，2002，215（3）：448-456.

[8]OsborneCP，SackL.EvolutionofC4plants：anewhypothesisforaninteractionofCO2andwaterrelationsmediatedbyplanthydraulics[J].PhilosophicalTransactionsoftheRoyalSocietyofLondon.SeriesB，BiologicalSciences，2012，367（1588）：583-600.

[9]陳緒清，張曉東，梁榮奇，等.玉米C4型pepc基因的分子克隆及其在小麥的轉(zhuǎn)基因研究[J].科學(xué)通報，2004，49（19）：1976-1982.

[10]HudspethRL，GrulaJW，DaiZ，etal.Expressionofmaizephosphoenolpyruvatecarboxylaseintransgenictobacco[J].PlantPhysiology，1992，98（2）：458-464.

[11]HuslerRE，HirschHJ，KreuzalerF，etal.OverexpressionofC4-cycleenzymesintransgenicC3plants：abiotechnologicalapproachtoimproveC3-photosynthesis[J].JournalofExperimentalBotany，2002，53（369）：591-607.

[12]AgarieS，MiuraA，SumikuraR，etal.OverexpressionofC4PEPCcausedO2-insensitivephotosynthesisintransgenicriceplants[J].PlantScience，2002，162（2）：257-265.

[13]MerkelbachS，GehlenJ，DeneckeM，etal.Cloning，sequenceanalysisandexpressionofacDNAencodingactivephosphoenolpyruvatecarboxylaseoftheC3plantSolanumtuberosum[J].PlantMolecularBiology，1993，23（4）：881-888.

[14]FukayamaH，TsuchidaH，AgarieS，etal.SignificantaccumulationofC4-specificpyruvate，orthophosphatedikinaseinaC3plant，rice[J].PlantPhysiology，2001，127（3）：1136-1146.

[15]FukayamaH，TamaiT，TaniguchiY，etal.Characterizationandfunctionalanalysisofphosphoenolpyruvatecarboxylasekinasegenesinrice[J].ThePlantJournal：forCellandMolecularBiology，2006，47（2）：258-268.

[16]BrownRH，BassettCL，CameronRG，etal.PhotosynthesisofF1hybridsbetweenC4andC3-C4speciesofflaveria[J].PlantPhysiology，1986，82（1）：211-217.

[17]AgarieS，KaiM，TakatsujiH，etal.ExpressionofC3andC4photosyntheticcharacteristicsintheamphibiousplantEleocharisvivipara：structureandanalysisoftheexpressionofisogenesforpyruvate，orthophosphatedikinase[J].PlantMolecularBiology，1997，34（2）：363-369.

[18]SleightSC，SauroHM.BioBrickTM：assemblyusingthein-fusionPCRcloningkit[J].MethodsinMolecularBiology，2013，1073：19-30.

[19]韓凱，翁建峰，郝轉(zhuǎn)芳，等.一種快速高效構(gòu)建植物表達(dá)載體的方法[J].玉米科學(xué)，2012，20（1）：61-66.

[20]林春晶，韋正乙，蔡勤安，等.幾種植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法[J].生物技術(shù)，2008，18（5）：84-87.

[7]BlsingOE，ErnstK，StreubelM，etal.Thenon-photosyntheticphosphoenolpyruvatecarboxylasesoftheC4dicotFlaveriatrinervia—implicationsfortheevolutionofC4photosynthesis[J].Planta，2002，215（3）：448-456.

[8]OsborneCP，SackL.EvolutionofC4plants：anewhypothesisforaninteractionofCO2andwaterrelationsmediatedbyplanthydraulics[J].PhilosophicalTransactionsoftheRoyalSocietyofLondon.SeriesB，BiologicalSciences，2012，367（1588）：583-600.

[9]陳緒清，張曉東，梁榮奇，等.玉米C4型pepc基因的分子克隆及其在小麥的轉(zhuǎn)基因研究[J].科學(xué)通報，2004，49（19）：1976-1982.

[10]HudspethRL，GrulaJW，DaiZ，etal.Expressionofmaizephosphoenolpyruvatecarboxylaseintransgenictobacco[J].PlantPhysiology，1992，98（2）：458-464.

[11]HuslerRE，HirschHJ，KreuzalerF，etal.OverexpressionofC4-cycleenzymesintransgenicC3plants：abiotechnologicalapproachtoimproveC3-photosynthesis[J].JournalofExperimentalBotany，2002，53（369）：591-607.

[12]AgarieS，MiuraA，SumikuraR，etal.OverexpressionofC4PEPCcausedO2-insensitivephotosynthesisintransgenicriceplants[J].PlantScience，2002，162（2）：257-265.

[13]MerkelbachS，GehlenJ，DeneckeM，etal.Cloning，sequenceanalysisandexpressionofacDNAencodingactivephosphoenolpyruvatecarboxylaseoftheC3plantSolanumtuberosum[J].PlantMolecularBiology，1993，23（4）：881-888.

[14]FukayamaH，TsuchidaH，AgarieS，etal.SignificantaccumulationofC4-specificpyruvate，orthophosphatedikinaseinaC3plant，rice[J].PlantPhysiology，2001，127（3）：1136-1146.

[15]FukayamaH，TamaiT，TaniguchiY，etal.Characterizationandfunctionalanalysisofphosphoenolpyruvatecarboxylasekinasegenesinrice[J].ThePlantJournal：forCellandMolecularBiology，2006，47（2）：258-268.

[16]BrownRH，BassettCL，CameronRG，etal.PhotosynthesisofF1hybridsbetweenC4andC3-C4speciesofflaveria[J].PlantPhysiology，1986，82（1）：211-217.

[17]AgarieS，KaiM，TakatsujiH，etal.ExpressionofC3andC4photosyntheticcharacteristicsintheamphibiousplantEleocharisvivipara：structureandanalysisoftheexpressionofisogenesforpyruvate，orthophosphatedikinase[J].PlantMolecularBiology，1997，34（2）：363-369.

[18]SleightSC，SauroHM.BioBrickTM：assemblyusingthein-fusionPCRcloningkit[J].MethodsinMolecularBiology，2013，1073：19-30.

[19]韓凱，翁建峰，郝轉(zhuǎn)芳，等.一種快速高效構(gòu)建植物表達(dá)載體的方法[J].玉米科學(xué)，2012，20（1）：61-66.

[20]林春晶，韋正乙，蔡勤安，等.幾種植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法[J].生物技術(shù)，2008，18（5）：84-87.