溫玉潔，趙文龍，葛紅霞

（張掖市森林病蟲害防治檢疫站，甘肅 張掖734000）

馬兜鈴（Aristolochia debilis Sieb et Zucc）屬于馬兜鈴科（Aristolochiaceae）馬兜鈴屬（Aristolochia）植物，全世界約有450余種，廣泛分布在熱帶和溫帶地區(qū)，我國有56種，其中《中國植物志》記載39種，分別屬于管花亞屬和馬兜鈴亞屬［1］。主要分布于我國黃河以南及長江流域，是一種用途廣泛的中藥材。根入藥為青木香，有行氣止痛，解毒消腫之效；莖入藥為天仙藤，能疏風(fēng)活血；果實(shí)入藥為馬兜鈴，能清肺降氣，止咳平喘［2］。據(jù)調(diào)查在隴西就有試種，是一種值得廣泛種植并能夠帶來良好經(jīng)濟(jì)效益的中藥材之一［3］。

隨著馬兜鈴等中草藥在我省的普遍種植，病害開始頻繁發(fā)生，近年來，據(jù)調(diào)查，灰霉病發(fā)生較重，病毒病也普遍發(fā)生。查閱資料，關(guān)于中草藥的病毒病在國內(nèi)就有研究報(bào)道，如朱本明、陳作義等［4］檢測(cè)出地黃黃斑病病株中的地黃黃斑病毒；余方平、楊力［5］從河南等地的地黃上分離到4種病毒，其中2種分別鑒定為煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）；申屠蘇蘇、王海利等［6］在半夏中檢測(cè)到的病毒主要為黃瓜花葉病毒的天南星科株系和大豆花葉病毒（Soybean mosaic virus，SMV）的天南星科株系，而關(guān)于馬兜鈴中的病毒病未見報(bào)道。因此，筆者對(duì)甘肅省馬兜鈴產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的病毒進(jìn)行檢測(cè)，以期為馬兜鈴病毒病的防治提供依據(jù)。

關(guān)于病毒病的檢測(cè)技術(shù)，目前有很多有效而且快速的方法，常用的有指示植物法、電子顯微鏡診斷法、PCR檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)法等診斷方法［7］。其中PCR檢測(cè)法是一種選擇性體外酶促合成DNA片段的技術(shù)，它包括三個(gè)基本步驟：變性，退火，延伸。主要有反轉(zhuǎn)錄PCR，多重PCR，實(shí)時(shí)熒光PCR等［8］；血清學(xué)檢測(cè)方法具有很高的特異性，靈敏度也高，常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附法.間接ELISA、雙抗體夾心法等多種測(cè)試方法。其中最主要的、應(yīng)用最多的是雙抗體夾心法和間接法，瓊脂雙擴(kuò)散法，斑點(diǎn)免疫法［9］。如侯紅琴、譚志瓊等［10］提出利用病毒基因組核苷酸序列相似性來進(jìn)行病毒種或株系的劃分已成為病毒分類的一個(gè)有效手段；王敏、李明福等［11］對(duì)河南省焦作地區(qū)和山東省菏澤產(chǎn)地的地黃病毒病疑似樣本，利用血清學(xué)、PCR并結(jié)合序列測(cè)定等方法進(jìn)行鑒定與檢測(cè)，張樺、黃煒等［12］還應(yīng)用ELISA和PCR方法對(duì)小麥腥黑穗病菌進(jìn)行檢測(cè)研究。因此，根據(jù)這些資料，筆者擬采用雙抗夾心法和RTPCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)馬兜鈴病毒病的毒源種類，以期精確檢測(cè)出甘肅省馬兜鈴病毒病的主要毒源種類，為制定綜合防治策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 2012年7月在甘肅定西岷縣、隴西地區(qū)采集馬兜鈴病株，癥狀類型依據(jù)采集時(shí)間的不同進(jìn)行編號(hào)，并在實(shí)驗(yàn)室－80℃冰箱凍存。

1.1.2 藥品 血清學(xué)測(cè)定采用TIANGEN Agdia公司生產(chǎn)的酶聯(lián)診斷試劑盒。包括：煙草花葉病毒、番茄花葉病毒（ToMV，Tomato mosaic virus）、馬鈴薯Y病毒（PVY，Potato virus Y）、馬鈴薯X病毒（PVX，Potato virus X）、黃瓜花葉病毒。

植物總RNA提取試劑盒購自天根公司。

1.1.3 儀器 研缽、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、高速冷凍離心機(jī)、移液槍、37℃恒溫箱、酶標(biāo)儀（450nm）、96孔酶聯(lián)板、微量移液器、PCR擴(kuò)增儀。

1.2 方法

1.2.1 癥狀分類 對(duì)采集到的樣品根據(jù)癥狀類型，進(jìn)行分類，照相。

1.2.2 馬兜鈴病毒病毒源的血清學(xué)檢測(cè) DASELISA雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)病毒具體步驟：

（1）樣本制備：切割樣本，分別置于滅菌研缽中，加一定量的PBS（pH7.4），迅速將樣本勻漿充分。4℃下6 000r·min－1離心20min，仔細(xì)收集上清液，將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，根據(jù)檢測(cè)需要設(shè)計(jì)96孔酶聯(lián)板，每個(gè)重復(fù)3次，空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑（表1）。

（2）包被抗體：將 TMV、ToMV、CMV、PVX、PVY的抗體按照要求的濃度（200∶1）和需要的體積，用包被緩沖液稀釋包被的抗體并且在每孔中加入100μL抗體IgG溶液，孵育4h或者4℃冰箱過夜。

表1 酶聯(lián)板點(diǎn)樣孔排列

（3）洗板：空干后用1×PBST洗滌液洗滌酶聯(lián)板3次。

（4）加液：每孔加入100μL PNP溶液，室溫孵育0.5h。

1.2.3 馬兜鈴病毒病的RT－PCR檢測(cè) 當(dāng)DAS－ELISA試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為陽性或疑似樣品時(shí)，進(jìn)行RT－PCR檢測(cè)。

（1）植物基因組總RNA的提取

采用Tiangen RNA prep Pure Plant Kit植物總RNA提取試劑盒提取，試驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，具體步驟如下：

1）勻漿處理：50～100mg植物葉片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μL RL，渦旋劇烈震蕩均勻。

2）移液離心：將所有溶液移至過濾柱CS上，12 000r·min－1離心2～5min，小心吸取收集管中的上清至Rnase－free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀。

3）轉(zhuǎn)液：緩慢加入0.5倍上清體積的無水乙醇，混勻，將得到的沉底和溶液一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，12 000r·min－1離心30～60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。

4）收集：向吸附柱CR3中加入350μL蛋白液RW1，12 000r·min－1離心30～60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。

5）DNase I工作液的配制：取10μL DNase I儲(chǔ)存液放到新的Rnase－Free離心管中，加入70μL rRDD溶液，輕柔混勻。

6）加液：向吸附柱CR3中央加入80μL的Dnase I工作液，室溫放置15min。

7）重復(fù)步驟4）。

8）漂洗收集：向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，室溫靜置2min，12 000r·min－1離心30～60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。

9）重復(fù)步驟8）。

10）晾干漂洗液：12 000r·min－1離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CR3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

11）靜置：將吸附柱CR3放入一個(gè)新的Rnase－Free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30～100μL Rnase－Free dH2O，室溫放置2min，12 000r·min－1離心2min，得到RNA溶液。

（2）引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已發(fā)表的CMV和ToMV的外殼蛋白基因序列［6－8］，設(shè)計(jì)引物序列：

CMV上游引物：Pcmv1d：5’－GCCGTAAGCTGGATGGACAA－3’，下游引物：Pcmv2u：5’－TATGATAAGAAGCTTGTTTCGCG－3’。

ToMV上游引物：PTob－Uni1：5’－ATTTAAGTGGASGGAAAAVCACT－3’，下游引物：PTomvf：5’－CGGAAGGCCTAAACCAAAAAG－3’。

（3）RT－PCR反應(yīng)體系

根據(jù)預(yù)試結(jié)果，建立優(yōu)化反應(yīng)體系：2×1step Buffer 12.5μL，PrimeScript 1step Enzyme Mix 1 μL，引物1、引物2 （10μM）各1μL，Rnase Free dH2O 8μL，RNA模板1.5μL。

（4）RT－PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

根據(jù)預(yù)試結(jié)果，建立優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性30min；94℃變性3min，94℃退火30s，48℃退火45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

（5）PCR產(chǎn)物電泳

PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳和EB染色觀察。制備2%瓊脂糖凝膠，待冷卻至50～60℃時(shí)，加入EB混勻后倒入已經(jīng)封好的凝膠平臺(tái)上。10μL樣品中加入2μL 5×loading Buffer，混勻加樣，電泳槽中進(jìn)行電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀

從田間采集到的馬兜鈴病毒病主要有2種癥狀類型：黃斑型，葉片的葉肉組織出現(xiàn)大小不等的黃色斑塊，有些組織褪綠形成隱約可見的黃斑，而有些組織形成明顯可見的近圓形鮮黃色斑塊，整體葉片變小并呈現(xiàn)缺刻變形（圖1）；網(wǎng)紋型，葉片大小葉脈組織均變黃，葉肉組織為正常綠色，整個(gè)葉片形成黃色網(wǎng)紋型癥狀（圖2）。

圖1 馬兜鈴病毒病黃斑型癥狀

圖2 馬兜鈴病毒病網(wǎng)紋型癥狀

2.2 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 DAS－ELISA檢測(cè)結(jié)果所得數(shù)據(jù)（表2）

表2 酶標(biāo)儀數(shù)據(jù)

若樣品對(duì)照OD405值/陰性對(duì)照OD405值明顯＞2，為陽性；若樣品對(duì)照OD405值/陰性對(duì)照OD405值在閾值附近，判為可疑樣品，需重做一次，再用RT－PCR方法加以驗(yàn)證。試驗(yàn)表明：在待測(cè)黃斑型樣品中，CMV I/H 值為4.14，初步確定為陽性樣品，而ToMV I/H值為1.90，在其閾值范圍內(nèi)，則為可疑樣品，需用RT－PCR進(jìn)一步檢測(cè)，而其余三種病毒試劑盒檢測(cè)的馬兜鈴病葉汁液OD405均在1.5以下，則為陰性，即在馬兜鈴病葉中并未檢測(cè)到TMV、PVX、PVY這三種病毒。在網(wǎng)紋型樣品中對(duì)照OD405值明顯小于陰性對(duì)照OD405值，所以排除了網(wǎng)紋型樣品中含有這幾種病毒的可能。

2.3 RT－PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)DAS－ELISA檢測(cè)后的一個(gè)陽性樣品和一個(gè)疑似樣品進(jìn)一步通過RT－PCR檢測(cè)，結(jié)果表明：已擴(kuò)增到了CMV約485bp［13］的特異性序列和ToMV約686bp［14］的特異性序列，表明在馬兜鈴黃斑型病葉中含有CMV和ToMV（圖3）。

圖3

3 小結(jié)與討論

通過DAS－ELISA檢測(cè)和RT－PCR分子檢測(cè)，結(jié)合采集到的馬兜鈴樣本上的癥狀，明確了CMV、ToMV是侵染我省馬兜鈴的主要病毒毒源，并且在黃斑型的癥狀中均檢測(cè)到這兩種病毒，說明存在復(fù)合侵染的現(xiàn)象。ELISA法的靈敏度不夠高，而且容易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。與ELISA相比，RT－PCR克服了抗原制備抗血清的種種弊端，并且含量極低的樣品也可檢測(cè)出，其靈敏性、特異性遠(yuǎn)超過ELISA方法，但是RT－PCR反應(yīng)條件嚴(yán)格，反應(yīng)體系中的諸多因素都會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。本試驗(yàn)根據(jù)TaKaRa公司的引物，通過ELISA和RT－PCR方法成功對(duì)我省定西、隴西馬兜鈴上的CMV、ToMV進(jìn)行了檢測(cè)，表明這兩種方法是檢測(cè)馬兜鈴病毒病的有效方法。在本實(shí)驗(yàn)中，田間自然感病馬兜鈴是否還受其他病毒感染，以及是否存在單獨(dú)侵染，還有待于進(jìn)一步研究。

［1］趙輝，劉繡華.馬兜鈴屬藥用植物研究概況［J］.河南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003（4）：73－77

［2］程紹云，徐同印.馬兜鈴的栽培技術(shù)［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2003，14（11）：713

［3］趙汝能.甘肅中草藥資源志（下冊(cè)）［M］.蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，2007：182－183

［4］朱本明，陳作義.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)地黃黃斑病毒［J］.自然雜志，1981，4（4）：319－320

［5］余方平，楊立.地黃花葉病的初步研究［J］.植物病理學(xué)報(bào)，1994，24（4）：310

［6］申屠蘇蘇，王海麗，陳集雙，等.三葉半夏的2種病毒檢測(cè)［J］.中國中藥雜志，2007（8）：664－667

［7］劉岑岑.煙草病毒的檢測(cè)方法［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，15（16）：41－65

［8］王惠哲，李淑菊，霍振榮，等.黃瓜花葉病毒的RT－PCR檢測(cè)［J］.長江蔬菜，2004，19（3）：100－102

［9］溫學(xué)森，李先恩，楊世林.地黃病毒病及其亟待解決的問題［J］.中草藥，2001，32（7）：88－90

［10］侯紅琴，譚志瓊，張振臣.煙草花葉病毒屬研究新進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（5）：304－307

［11］王敏，李明福，黃璐琦，等.栽培地黃（Rehmannia glutinosa Lidosch）普遍感染 TMV和CMV［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2006，36（2）：189－192

［12］張樺，黃煒，邱焯，等.ELISA和PCR檢測(cè)在小麥矮腥黑穗病研究中的應(yīng)用初探［J］.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（4）：88－90

［13］Singh，Z ＆Jones R.A.C ＆Jones M.G.K.Identification of Cucumber mosaic virus subgroup I isolates from banana plants affected by infectious chlorosis disease using RT－PCR［J］.Plant Disease，1995，79（7）：713－716

［14］Bettina，L ＆ Günter A ＆ Dietrich－Eckhardt L，et al.Detection and differentiation of serologically cross－reacting tobamo viruses of economical importance by RT－PCR and RT－PCR－RFLP［J］.Journal of Virological Methods，2002，106：1－10