楊勝波， 丁憲群， 牛 剛， 張 建， 楊媛媛

(1. 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550001;2. 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng)550001)

重癥急性胰腺炎(severe acute panereatitis，SAP)是胰腺組織自身消化為基礎(chǔ)與胰腺自身的壞死為主要特征的全身性疾病，可以引起局部和全身性的過度炎癥反應(yīng)，造成血管滲出、低血容量、休克及多臟器功能障礙等系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，甚至可以導(dǎo)致多器官功能衰竭(MODS)。其中，腎功能障礙的發(fā)生率僅次于肺功能障礙，大約占50%［1］，當(dāng)疾病發(fā)展到腎功能衰竭后，導(dǎo)致與其相關(guān)臟器衰竭的發(fā)生率也明顯上升。目前，胰腺炎發(fā)病機(jī)制并不完全明確，研究其發(fā)生與發(fā)展有關(guān)的通路及信號(hào)分子已經(jīng)成為熱點(diǎn)。其中，核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)就已經(jīng)成為研究的焦點(diǎn)。目前，NF-κB 已被證實(shí)在SAP 中表達(dá)量增加，由此可推斷該因子在SAP 發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色［2］。丹參和參附注射液具有抑制炎癥并改善微循環(huán)等功能，基于此，本實(shí)驗(yàn)采用丹參聯(lián)合參附注射液干預(yù)SAP大鼠腎損害模型，觀察其腎組織NF-κB 及血清Cr、BUN 的變化，旨在探討丹參和參附注射液可能的作用機(jī)制，為該藥在臨床上的運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)成年健康SD 大鼠72 只(第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK (渝)2014-005)。參附注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司，批號(hào)131023010);丹參注射液(正大青春寶公司，批號(hào)1405133);牛黃膽酸鈉(Sigma 公司);NF-κB/P65 (L523)亞單位一抗(Bioworld Technology 公司)。全自動(dòng)生化分析儀(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SAP 大鼠模型的建立［3］72 只SD 大鼠術(shù)前12 h 禁食，但予以自由飲水。水合氯醛麻醉后，脫毛膏腹部脫毛、固定、消毒，正中切口入腹，從肝十二指腸韌帶肝門側(cè)用小動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉膽胰管，4 號(hào)針頭由十二指腸前壁處進(jìn)針，經(jīng)乳頭部插入膽胰管內(nèi)，以0.2 mL/min 的速度向膽胰管內(nèi)推注5%?；悄懰徕c(0.1 mL/100 g)，見胰膽管擴(kuò)張后將針頭拔出，并加壓阻塞膽胰管進(jìn)入十二指腸的開口，2 min 后解除加壓，可見胰腺組織迅速出現(xiàn)水腫、充血、沿血管壁兩側(cè)出現(xiàn)發(fā)紅、片狀紫紅、或點(diǎn)狀，取下小動(dòng)脈夾并予以關(guān)腹。術(shù)后可自由飲水、禁食。

1.2.2 藥物干預(yù)SAP 大鼠模型 丹參聯(lián)合參附注射液治療組建模后立即由尾靜脈緩慢注射，丹參和參附注射液各0.2 mL/100 g［4］，假手術(shù)組、SAP 模型組予以注射等體積的生理鹽水。

1.2.3 標(biāo)本采集 藥物干預(yù)6、12、24 h 后予以麻醉，由原切口開腹，腹腔靜脈采取血液送檢;取胰腺及左腎標(biāo)本，觀察組織大體顏色、形態(tài)，并將其分別放于10%甲醛液中待作蘇木素-伊紅染色鏡檢，取右腎于80 ℃冰箱保存，待行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NF-κB 的表達(dá)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組實(shí)驗(yàn)均采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用±s 表示，組間資料比較采用ANOVA和t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAP 模型大鼠腎臟組織NF-κB 蛋白的表達(dá) 模型建立成功后，SAP 模型組腎臟NF-κB 的表達(dá)隨著時(shí)間的推移逐漸升高，在24 h 達(dá)到高峰，而SAP 丹參聯(lián)合參附治療組與其比較則有明顯的下降(P ＜0.01);假手術(shù)組NF-κB 的表達(dá)隨著時(shí)間的推移無(wú)明顯的變化(P ＞0.05);SAP 模型組與其他兩組相比較，NF-κB 的表達(dá)明顯增高(P ＜0.01)。提示丹參聯(lián)合參附注射液能夠抑制使SAP 模型大鼠腎損害腎臟NF-κB 的表達(dá)，見表1。

表1 SAP 模型大鼠腎臟組織NF-κB 蛋白的表達(dá)積分光密度(IOD)的變化(±s，n=8)

表1 SAP 模型大鼠腎臟組織NF-κB 蛋白的表達(dá)積分光密度(IOD)的變化(±s，n=8)

注:SAP 模型組與假手術(shù)組比較，* P ＜0.01;SAP 模型組與丹參聯(lián)合參附注射液治療組比較，Δ P ＜0.01;同組各時(shí)相比較，ψ P ＜0.01，下表同

組別 NF-κB 積分光密度(IOD)6 h 12 h 24 h假手術(shù)組7.46 ±0.550 7.26 ±0.833 7.33 ±0.815 SAP 模型組 31.58 ±3.805* 45.30 ±3.537* ψ 56.79 ±3.500* ψ丹參聯(lián)合參附注射液治療組 19.76 ±2.206Δ 30.41 ±3.314Δψ 40.89 ±3.435 Δψ

2.2 SAP 模型大鼠血清BUN、Gr 的變化 模型建立成功后，SAP 模型組血清Gr、BUN 隨著時(shí)間的推移逐漸升高，在24 h 達(dá)到高峰，而SAP 丹參聯(lián)合參附治療組與其比較則有明顯的下降(P ＜0.01);假手術(shù)組血清Gr、BUN 隨著時(shí)間的推移無(wú)明顯的變化(P ＞0.05);SAP 模型組與其他兩組相比較，血清Gr、BUN 明顯增高(P ＜0.01)。提示丹參聯(lián)合參附注射液能夠使SAP 模型大鼠腎損害血清Gr、BUN明顯下降，見表2。

表2 SAP 模型大鼠藥物干預(yù)后不同時(shí)間血清Gr、BUN 的變化(±s，n=8)

表2 SAP 模型大鼠藥物干預(yù)后不同時(shí)間血清Gr、BUN 的變化(±s，n=8)

組別 血清Gr/(mmol·L -1)血清BUN/(μmol·L -1)6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h假手術(shù)組 45.3 ±3.73 45.1 ±4.55Φ 45.6 ±3.62Φ 5.6 ±0.93 6.09 ±1.12Φ 5.8 ±1.10 Φ SAP 模型組 70.4 ±5.83* 90.9 ±5.72* ψ 127.1 ±5.99* ψ 9.9 ±0.91* 16.4 ±1.03* ψ 21.8 ±1.77#ψ丹參聯(lián)合參附注射液治療組 61.2 ±4.65#Δ 78.4 ±5.21#Δ Ω 94.1 ±5.00#Δ Ω 7.6 ±1.06#Δ 11.1 ±0.86#Δ Ω 17.2 ±1.10#Δ Ω

2.3 胰腺組織、腎組織蘇木素-伊紅染色 胰腺組織、腎組織通過蘇木素-伊紅染色后假手術(shù)組胰腺組織HE 染色顯示，組織結(jié)構(gòu)正常，腎臟無(wú)水腫、出血及壞死;SAP 丹參聯(lián)合參附治療組胰腺間質(zhì)局部出血，腎臟腎組織間質(zhì)出血，部分腎小球結(jié)構(gòu)破壞;SAP 模型組胰腺腺泡結(jié)構(gòu)破壞，有大片壞死灶，間質(zhì)水腫，胰腺間質(zhì)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，腎臟腎小球結(jié)構(gòu)破壞、間質(zhì)水腫，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1、圖2。

圖1 胰腺組織蘇木素-伊紅染色(×200)

圖2 腎臟組織蘇木素-伊紅染色(×200)

3 討論

重癥急性胰腺炎是臨床比較多見的且較為兇險(xiǎn)的疾病，病死率可以達(dá)到30% ～40%［5］，急性腎功能損害是SAP 嚴(yán)重的的并發(fā)癥之一。國(guó)外相關(guān)報(bào)道提示SAP 合急性腎功能損害的死亡率高達(dá)63%，而國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道則為50%左右［6-7］。

SAP 發(fā)病機(jī)制目前認(rèn)為是膽石的阻塞為主要誘因之一，膽石阻塞后導(dǎo)致胰液流出道嚴(yán)重受阻，膽汁逆流進(jìn)入胰管，胰管內(nèi)壓力不斷上升，進(jìn)而造成腺泡及胰管的破壞而導(dǎo)致SAP 發(fā)生。SAP 發(fā)生后胰腺可以釋放較多的血管活性多肽具有較強(qiáng)的腎毒性作用。隨著胰蛋白酶的明顯增加，可明顯激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)，從而啟動(dòng)腎小球的血管收縮，導(dǎo)致腎小球動(dòng)脈壓下降［8］，蛋白溶解酶可進(jìn)一步導(dǎo)致腎小球的通透性增加，繼發(fā)腎小管和腎間質(zhì)的損害，最終導(dǎo)致急性腎功能衰竭的發(fā)生。

核轉(zhuǎn)錄因子κB (NF-κB)是一種廣泛存在于人體組織和細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子，主要參與調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥、胚胎發(fā)育、組織損傷和修復(fù)等相關(guān)的基因表達(dá)［9-10］。相關(guān)研究顯示，多種炎性因子如IL-1、TNF-ɑ、IE 等啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子基因中存在κB 的相關(guān)序列，而NF-κB 可誘導(dǎo)相關(guān)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，從而激活相關(guān)基因及早期炎癥反應(yīng)基因，產(chǎn)生較多的炎癥因子［11］。Gukovsky 等［12］在SAP 動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)建模30 min 后即有NF-κB 較高的表達(dá)，并指出NF-κB 的高表達(dá)在急性胰腺炎的炎性反應(yīng)中至關(guān)重要，可以引起SAP胰腺組織中炎性介質(zhì)的釋放增加。SAP 的發(fā)生、發(fā)展，NFκB 的活化成為其發(fā)病的使動(dòng)作用。另外，炎性因子的大量釋放，又可以調(diào)劑NF-κB 的進(jìn)一步活化，從而導(dǎo)致SAP 發(fā)生、發(fā)展進(jìn)入惡性循環(huán)。由此可見，NF-κB 的活化在SAP疾病發(fā)生、發(fā)展過程中誘導(dǎo)大量的炎性因子參與，從而導(dǎo)致胰腺出現(xiàn)嚴(yán)重的病理生理的改變，進(jìn)而出現(xiàn)一系列的臨床表現(xiàn)。

中醫(yī)認(rèn)為丹參具有活血通絡(luò)、涼血消癰、祛瘀止痛等功效，近年來(lái)，大量的臨床研究表明，丹參具有擴(kuò)張微血管和改善微循環(huán)等臨床作用，朱穎煒等［13］臨床觀察結(jié)合應(yīng)用丹參注射液治療可以減少SAP 并發(fā)癥的發(fā)生率，且能降低死亡率和縮短療程，提高治愈率;劉明東等［3］認(rèn)為丹參能抑制內(nèi)毒素引起的促炎遞質(zhì)如一氧化氮(NO)、TNF-α，IL-1β 等的產(chǎn)生。而參附注射液具有回陽(yáng)救逆，益氣固脫的功效，主要用于陽(yáng)氣暴脫的厥脫癥，中醫(yī)認(rèn)為氣能攝血，氣能行血，初云海等［14］研究表明參附注射液能改善腎血流灌注機(jī)制保護(hù)腎損傷，并且具有通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而達(dá)到減輕自由基損傷。故本實(shí)驗(yàn)選用丹參聯(lián)合參附注射液作為實(shí)驗(yàn)用藥。

本實(shí)驗(yàn)采用膽胰管逆行注射?；悄懰徕c誘導(dǎo)大鼠SAP模型。建模成功后可觀察到胰腺組織充血水腫，甚至出現(xiàn)點(diǎn)狀、片狀的出血灶，同時(shí)可觀察腎臟充血水腫等;而光鏡下可見胰腺腺泡被破壞，間質(zhì)出現(xiàn)水腫，甚至出血，且有大量粒細(xì)胞聚集浸潤(rùn);同時(shí)腎間質(zhì)出現(xiàn)水腫出血，粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腎小球破壞。模型組與假手術(shù)組比，NF-κB的表達(dá)增加，血清肌酐、尿素氮均升高;SAP 丹參聯(lián)合參附治療組與SAP 模型組相比，NF-κB 蛋白的表達(dá)以及血清Cr、BUN 減少，而光鏡下可見丹參聯(lián)合參附治療組胰腺、腎臟組織炎癥較SAP 模型組明顯減輕。說明丹參聯(lián)合參附注射液能夠抑制SAP 大鼠腎臟組織的NF-κB 的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，有效控制血清Cr、BUN 的水平，從而達(dá)到治療SAP 及保護(hù)腎功能的作用。

［1］ 鄭文娟. 丹參川芎嗪對(duì)重癥急性胰腺炎腎損傷患者內(nèi)皮功能及血液流變學(xué)的影響研究［J］. 新中醫(yī)，2014，46(6):79-81.

［2］ 幸 福，雷力民，韋運(yùn)達(dá)，等. 中醫(yī)藥治療重癥胰腺炎機(jī)制探討及實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展［J］. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，15(12):114-115.

［3］ 劉明東，石亮亮，鄒曉平. 丹參酮ⅡA 對(duì)急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷的干預(yù)作用［J］. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2011，19(1):18-22.

［4］ 鄭幫瑞. 丹參注射液對(duì)重癥胰腺炎大鼠胰腺NF-κB 活化的影響［D］. 汕頭:汕頭大學(xué)，2007.

［5］ 龐元龍，王細(xì)文. 急性重癥胰腺炎106 例治療體會(huì)［J］. 激光雜志，2011，32(4):75-76

［6］ Miskovitz P. Scoring of multiple organ dysfunction in patients with severe acute pancreatitis［J］. Crit Care Med，2002，30(6):1390-1391.

［7］ 樊 恒，趙 宇，宋甫春. 生大黃對(duì)重癥急性胰腺炎并發(fā)腎損傷大鼠的治療作用［J］. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2012，20(7):308-310.

［8］ 解叔蕊，田曉鵬，趙慧敏，等. 燈盞花素對(duì)老年重癥急性胰腺炎腎臟的保護(hù)作用［J］. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2013，21(9):456-459.

［9］ Baker R G，Hayden M S，Ghosh S，et al. NF-κB，inflamination，and metbaolic disease［J］. Cell Metibolism，2011，13(1):11-22.

［10］ Varfomeev E，Goncharov T，Maecker H，et al. Cellular inhibitors of apoptosis are global reglators of NF-kappaB and MAPK actviation by members of the TNF family of recepotrs［J］.Sci Signal，2012，5(216):216-222.

［11］ 周秉舵，王曉素，方盛泉，等. 清下解胰方對(duì)重癥胰腺炎大鼠TLR4/ NF-κB 信號(hào)通路的影響［J］. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35(12):830-834

［12］ Gukovsky I，Gukovskaya A S，Blinman T A，et al. Early NFkappaB activation is associated with hormone-induced Panereatitis［J］. Am J Physiol，1998，275:1402-1414.

［13］ 朱穎煒，范 麗，吳夢(mèng)穎，等. 奧曲肽聯(lián)合β-七葉皂甙鈉或復(fù)方丹參治療急性重癥胰腺炎［J］. 江蘇醫(yī)藥，2011，37(11):1345-1346.

［14］ 初云海，王 藝，胡占良. 參附注射液對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎腎損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2009，47(18):41-45.