劉 彩， 白銀亮， 賀東強

(1. 蘭州大學第二醫(yī)院藥學部，甘肅 蘭州730030;2. 蘭州大學第二醫(yī)院VIP 外科，甘肅 蘭州730030)

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是老年患者術后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，主要臨床表現(xiàn)為術后學習、記憶及定向等認知功能障礙［1］。迄今為止，POCD 的確切發(fā)病機制尚不清楚。既往研究報道動物術后早期的認知功能障礙主要與術后外周和中樞海馬炎癥因子過度釋放有關，而且針對炎癥反應的治療措施能夠預防和減輕術后早期的認知功能障礙［2］。

香菇多糖(lentinan)是香菇子實體細胞壁的結構成分，是香菇的主要藥理活性成分之一［3］，具有抑制急慢性炎癥反應作用［4-5］。目前，香菇多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑已廣泛應用于臨床，但其對術后炎癥反應和認知障礙的作用至今尚未見報道。本實驗擬建立老年小鼠肝葉部分切除術模型，評價香菇多糖對術后炎癥反應及認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性ICR 小鼠，鼠齡12 月，體質量30 ～34 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號HNASLKJ20130513。

1.2 藥物及試劑 香菇多糖粉針(1 mg，批號130202，南京綠葉思科制藥有限公司)。兔源抗TNF-α、IL-1β、IL-6抗體(Abcam 公司);HRP 結合的羊抗兔二抗(Jackson 公司);TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒 (R＆D 公司);BCA 蛋白定量試劑盒、RIPA 裂解液(碧云天生物技術有限公司);蛋白酶抑制劑混合片(Roche 公司)。

1.3 實驗儀器 Morris 水迷宮(上海移數(shù)信息科技有限公司);全波長酶標儀(美國Thermo 公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型建立及分組 實驗分正常對照組、假手術組、手術組、香菇多糖組。根據(jù)文獻方法建立老年小鼠肝葉部分切除術模型［6］。10% 水合氯醛腹腔注射(4 mL/kg )麻醉，待翻正反射消失后固定，消毒并于劍突下腹部正中切開約2.0 cm 切口，打開腹腔并分離肝臟左側葉，在遠端蒂部7 號絲線結扎后切除結扎外側的肝臟組織，止血后逐層關腹。假手術組麻醉后于腹部相同部位做切開縫合術。根據(jù)文獻［5］，選用香菇多糖灌胃劑量為20 mg/kg。香菇多糖組于術前7 d 開始直至術后第2 天灌服香菇多糖，每天1次。假手術組和手術組灌服同體積的生理鹽水。

1.4.2 Morris 水迷宮測試 術前6 d 進行水迷宮訓練，每只動物每天訓練4 次。每次將動物面向池壁放入水中，讓其尋找到水中的平臺(置于第Ⅰ象限水面下1 cm 處)，所耗時間記為潛伏期。設定尋找平臺的最大時限為60 s (即在60 s 內(nèi)未找到平臺者停止記錄，并將潛伏期記為60 s)。撤去水中平臺，選取原平臺正對象限(第Ⅲ象限)為入水點，并將動物面向池壁放入水中，動物自由游泳60 s，記錄60 s 內(nèi)動物穿過平臺區(qū)的次數(shù)。選取最后4 次測試結果的平均值為手術前成績。手術后第2 天分別進行上述測試并記錄潛伏期和穿臺次數(shù)。

1.4.3 ELISA 檢測 Morris 水迷宮測試結束后，水合氯醛麻醉小鼠，經(jīng)眼眶采血約1 mL，室溫靜置2 h 后，離心收集血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附法檢測TNFα、IL-1β 和IL-6 的表達，操作均按試劑盒說明書完成。

1.4.4 Western blot 檢測 參考文獻［2］方法，斷頭處死小鼠，于冰上快速分離雙側海馬，液氮冷凍后移至-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩吮痉Q定質量后按照質量∶體積(mg/μL)為1 ∶9加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液中于冰上勻漿15 min，4 ℃、12 000 r/min 離心并提取上清。采用BCA 法對所提蛋白進行定量，規(guī)定上樣總蛋白量為40 μg。按1 ∶4 加入5 ×SDS 上樣緩沖液沸水浴中5 min，10%SDS-PAGE膠電泳轉膜各2 h。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h 后，TBST 洗膜3 × 10 min，加人一抗TNF-α、IL-1β、IL-6 抗體 (1 ∶2 000)，4 ℃過夜。用TBST 洗膜后加入二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，漂洗后ECL 法顯色，膠片掃描后使用Image pro plus 軟件分析積分光密度值。

2 結果

2.1 香菇多糖對部分肝切除小鼠術后認知功能的影響 術前水迷宮潛伏期和穿臺次數(shù)各組動物之間差異均沒有統(tǒng)計學意義，表明香菇多糖對正常小鼠認知功能無明顯影響。術后假手術組與正常對照組相比，潛伏期略有延長，穿臺次數(shù)略有減少，但差異沒有統(tǒng)計學意義。與假手術組相比，手術組潛伏期顯著性延長(P ＜0.01)，穿臺次數(shù)明顯減少(P ＜0.01)。香菇多糖能夠有效抑制肝切除術誘導的小鼠術后潛伏期延長(P ＜0.05)和穿臺次數(shù)減少(P ＜0.05)，見表1。

2.2 香菇多糖對部分肝切除小鼠術后外周血炎癥細胞因子表達的影響 與正常對照組比較，假手術組、手術組和香菇多糖組外周血中TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達水平均明顯升高(P 值均小于0.05)，手術組TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達水平明顯高于假手術組(P 值均小于0.01)。與手術組比較，香菇多糖組TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達水平明顯降低，可見香菇多糖能夠有效抑制肝切除術誘導的小鼠術后外周血炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達，見表2。

表1 香菇多糖對部分肝切除老年小鼠術后認知功能的影響(±s，n=10)

表1 香菇多糖對部分肝切除老年小鼠術后認知功能的影響(±s，n=10)

注:與假手術組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與手術組比較，* P ＜0.05

組別潛伏期/s 穿臺次數(shù)/次術前 術后 術前 術后正常對照組22.3 ±3.6 22.6 ±4.3 5.1 ±1.1 5.0 ±1.5假手術組 22.7 ±4.5 24.8 ±7.8 5.4 ±2.3 4.7 ±1.1手術組 21.9 ±4.7 34.1 ±6.2## 5.0 ±1.7 3.4 ±1.2##香菇多糖組 22.1 ±3.7 28.9 ±5.6#* 5.2 ±1.3 4.2 ±1.4#*

表2 香菇多糖對部分肝切除小鼠術后外周血炎癥細胞因子表達的影響(±s，n=10)

表2 香菇多糖對部分肝切除小鼠術后外周血炎癥細胞因子表達的影響(±s，n=10)

注:與假手術組比較，## P ＜0.01;與手術組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與正常對照組比較，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01

組別TNF-α/(pg·mL -1)IL-1β/(pg·mL -1)IL-6/(pg·mL -1)6.4 ±1.2 7.6 ±3.2 5.3 ±1.6假手術組 10.8 ±4.6Δ 16.3 ±6.2Δ 17.6 ±8.2Δ手術組 36.2 ±9.3ΔΔ## 48.1 ±13.2ΔΔ## 46.5 ±12.8ΔΔ#香菇多糖組 13.8 ±7.2Δ* 21.5 ±9.6Δ＊＊ 21.9 ±10.6Δ*正常對照組

2.3 香菇多糖對部分肝切除小鼠術后海馬組織炎癥細胞因子表達的影響 術后假手術組與正常對照組相比，海馬組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 蛋白的表達均沒有統(tǒng)計學差異。與假手術組相比，手術組TNF-α、IL-1β 和IL-6 蛋白的表達均顯著性升高(P ＜0.05)，尤其是TNF-α 的表達。與手術組比較，香菇多糖組TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達水平明顯降低(P ＜0.05)，表明香菇多糖能夠有效抑制肝切除術誘導的小鼠術后海馬組織炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 升高，見圖1。

圖1 香菇多糖對部分肝切除小鼠術后海馬組織炎癥細胞因子表達的影響(±s，n=10)

3 討論

Morris 水迷宮測試已被廣泛應用于嚙齒類動物空間學習記憶功能的評價，其中潛伏期和穿臺次數(shù)是最主要的評價指標［7］。本研究結果顯示肝葉部分切除術后小鼠潛伏期延長，穿臺次數(shù)減少，動物學習記憶能力下降，出現(xiàn)認知功能障礙。本研究結果顯示香菇多糖能夠有效改善肝葉部分切除術后小鼠的認知功能障礙，這屬首次報道。

近年來，有關術后認知功能障礙的病因及機制的研究已成為神經(jīng)科學研究的熱點之一，但其機制迄今仍不確切［8］。眾多動物實驗結果表明，圍術期手術操作所致的中樞和外周炎癥反應與早期術后認知功能障礙發(fā)生密切相關，尤其是細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的過度釋放所引起的動物記憶長時程增強(long-term potentiation，LTP)抑制被認為是而導致動物認知功能損害進而發(fā)生術后認知功能障礙的重要機制［2，9-10］。研究發(fā)現(xiàn)圍術期手術操作導致的組織損傷及應激反應能夠激活機體固有免疫系統(tǒng)，進而觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應，導致細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6等的過度釋放［11］，而且針對圍術期炎癥反應的治療措施對早期術后認知功能障礙具有明顯的改善作用［2，12-13］。這就表明抑制細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 等的過度釋放對于預防和減輕術后早期的認知功能障礙至關重要。

研究顯示外周炎癥反應的激活及細胞炎癥因子的釋放能夠明顯影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能［14］。本實驗研究結果表明肝葉部分切除術引起小鼠外周血中TNF-α、IL-1β 和IL-6的大量釋放，而香菇多糖對其具有明顯的抑制效應。中樞神經(jīng)炎癥反應，尤其是海馬炎癥反應被認為是動物術后早期的認知功能障礙發(fā)生的關鍵機制［15］。多項研究表明干預圍術期海馬炎癥因子的釋放對改善早期的認知功能障礙至關重要［2，9，16］。本研究結果顯示香菇多糖能夠有效抑制肝切除術誘導的小鼠術后海馬組織炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的過度釋放。結合Morris 水迷宮測試結果，我們發(fā)現(xiàn)外周血和海馬組織炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的過度釋放和認知功能下降呈對應關系，因此認為香菇多糖改善肝葉部分切除術后小鼠的認知功能障與其抑制外周血和海馬組織炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的過度釋放密切相關。

綜上所述，香菇多糖能夠有效改善部分肝切除老年小鼠術后認知功能障礙，其機制與抑制外周血和海馬組織中炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達有關。本研究無疑將為香菇多糖的臨床應用提供一種新的思路。

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