趙海梅， 黃敏芳， 劉端勇 ， 徐 榮， 王 馨， 鄒 勇， 岳海洋， 黃小英4

(1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方劑教研室，江西南昌330004;2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，江西南昌330004;3. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 科技學(xué)院，江西 南昌330025;4. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌330004)

磷脂酰肌醇-3 激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B (Akt)信號通路廣泛存在細(xì)胞中，通過激素受體、跨膜酪氨酸激酶受體和各種細(xì)胞內(nèi)因子應(yīng)答各種細(xì)胞內(nèi)、外信息，參與細(xì)胞生長、增殖、生存、分化、凋亡的重要信號通路［1-2］。近年來，隨著PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)該信號在腸道能通過大量的細(xì)胞因子介導(dǎo)異常炎癥反應(yīng)，引起結(jié)腸黏膜損傷，故在結(jié)腸炎發(fā)病中起到了重要作用［3］。黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)被證明有改善潰瘍性結(jié)腸炎的作用［4］，但是否通過PI3K/Akt 信號進(jìn)行調(diào)節(jié)目前鮮見報道。

1 材料和方法

1.1 材料 健康Sprague Dawley (SD)大鼠60 只，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號SCXK (京)2012-0001，雄性，體質(zhì)量(210 ±10)g。黃芪多糖(陜西森弗生物技術(shù)有限公司，批號HQ090312，純度98%);美沙拉嗪(葵花藥業(yè)集團(tuán)佳木斯鹿靈制藥有限公司，批號130407);2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid(TNBS)購于Sigma 公司，生產(chǎn)批號2508-19-2。PI3 Kinase p110α (C73F8)Rabbit mAb (批 號4249P)、Akt (pan)(11E7)Rabbit mAb (批號4685S)、Phospho-Akt (Ser473)(D9E)XP? Rabbit mAb (批號4060P)均購自于cell signal公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠結(jié)腸炎模型的建立 將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、黃芪多糖組、美沙拉嗪組，每組6 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后使用。參考文獻(xiàn)［5］復(fù)制TNBS 誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型。造模前禁食12 h，除正常組外，所有大鼠按體質(zhì)量用麻醉劑麻醉后，按100 mg/kg TNBS 計算，將TNBS 溶入0.3 mL 50%乙醇配制TNBS 乙醇復(fù)合溶液，用塑料軟管(直徑約為2 mm)將TNBS 乙醇復(fù)合液注入直腸內(nèi)距肛門約8 cm 處，倒置大鼠15 min，使藥液達(dá)結(jié)腸，然后動物放回原籠自然蘇醒，正常組注入等容積的50%乙醇，即造模成功。

1.2.2 給藥 造模24 h 后，按體質(zhì)量換算，黃芪多糖治療組和美沙拉嗪對照組分別用黃芪多糖(400 mg/kg)和美沙拉嗪(150 mg/kg)灌胃，正常組和模型組分別用等容積生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥7 d。

1.2.3 病理形態(tài)學(xué)觀察 第8 天，脫椎處死動物后，迅速分離結(jié)腸，縱向剪開結(jié)腸并清除其內(nèi)容物，在冰上將結(jié)腸展開，按文獻(xiàn)［6］方法肉眼觀察結(jié)腸損傷情況。取結(jié)腸保存于4%多聚甲醛溶液固定7 d 后，進(jìn)行石蠟組織包埋，切片后蘇木精-伊紅(HE)染色，按文獻(xiàn)［7］描述對結(jié)腸光鏡下潰瘍生成情況進(jìn)行評分。

1.2.4 Western blot 檢測PI3K、Akt、ρ-Akt 蛋白表達(dá) 將留取的結(jié)腸樣本迅速液氮冷凍，存于-80 ℃冰箱。剪取部分組織，錫箔紙包裹置于液氮，取出打碎后稱定質(zhì)量，冰上勻漿至組織完全裂解后，13 000 r/min 離心取上清，BCA法測定組織蛋白濃度，配制10%SDS-PAGE 凝膠，電泳，將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，TBS 沖洗，脫脂奶粉封閉1 h，加入適量rabbit anti-GAPDH (1 ∶2 000)、rabbit anti-PI3K (1 ∶1 000)rabbit anti-Akt (1 ∶1 000)、rabbit anti-Phospho-Akt (1 ∶2 000)，4 ℃過夜后洗膜，加入二抗，搖床上搖勻1 h，洗膜3 次，每次5 min。ECL 顯色3 min，放入暗盒曝光，具體時間各有不同。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0 分析，檢測結(jié)果均以±s 表示，組間比較采用t 檢驗，以P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理形態(tài)學(xué)觀察 肉眼觀察可見模型組大鼠結(jié)腸黏膜1 個或數(shù)個不等潰瘍形成、表面有黃色覆蓋物，周圍充血水腫，結(jié)腸明顯變厚，黃芪多糖給藥后，結(jié)腸潰瘍數(shù)量明顯減少，結(jié)腸變薄，充血水腫明顯減輕，肉眼下結(jié)腸損傷評分較模型組顯著下降(P ＜0.05)。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸可見結(jié)腸組織上皮缺失脫落、水腫液形成，大量炎細(xì)胞浸潤，淋巴濾泡增生明顯，毛細(xì)血管增生(P ＜0.05)。治療組大鼠潰瘍少見，少量炎細(xì)胞浸潤，鏡下病理損傷評分模型組明顯較正常組和黃芪多糖組偏高(P ＜0.05，表1)。提示黃芪多糖可有效治療大鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎。

表1 黃芪多糖對急性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的病理形態(tài)學(xué)觀察情況(±s，n=10)

表1 黃芪多糖對急性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的病理形態(tài)學(xué)觀察情況(±s，n=10)

注:與正常組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05

組別 劑量/(mg·kg -1)肉眼下?lián)p傷評分 病理損傷評分正常組0.30 ±0.48 0.50 ±0.53模型組 - 5.89 ±2.81* 7.40 ±1.58＊＊黃芪多糖組 400 2.43 ±2.23# 3.10 ±1.66#美沙拉嗪組 150 3.33 ±2.12# 2.50 ±1.27-#

2.2 PI3K、Akt、ρ-Akt 蛋白表達(dá)水平 如圖1 及表2 所示，各組大鼠結(jié)腸黏膜Akt 相對蛋白表達(dá)未見明顯差異。與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜PI3K/Akt 信號中PI3K 和ρ-Akt 蛋白水平明顯升高(P ＜0.05);與模型組比較發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖組大鼠結(jié)腸黏膜ρ-Akt 和PI3K 相對蛋白表達(dá)顯著下降(P ＜0.05)，同時ρ-Akt/Akt 蛋白表達(dá)水平比值顯著下調(diào)，提示黃芪多糖治療結(jié)腸炎大鼠可能是通過抑制結(jié)腸黏膜PI3K/Akt 信號活化來實現(xiàn)的。

圖1 結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中PI3K/Akt 信號活化情況

表2 Western blot 檢測大鼠結(jié)腸黏膜Akt、ρ-Akt 及PI3K 表達(dá)情況(±s，n=6)

表2 Western blot 檢測大鼠結(jié)腸黏膜Akt、ρ-Akt 及PI3K 表達(dá)情況(±s，n=6)

注:與正常組比較，* P ＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

組別 劑量/(mg·kg -1) Akt/GAPDH ρ-Akt/GAPDH ρ-Akt/ Akt PI3K/GAPDH正常組 - 100.00 ±0.00 100.00 ±0.00 0.29 ±0.11 100.00 ±0.00模型組 - 113.17 ±36.68 150.86 ±11.59* 0.55 ±0.17* 365.89 ±148.39*黃芪多糖組 400 98.36 ±11.95 44.73 ±15.30# 0.17 ±0.07# 179.25 ±94.49#美沙拉嗪組 150 98.75 ±23.54 73.96 ±16.03# 0.07 ±0.02# 167.44 ±80.05#

3 討論

PI3K 作為一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，在生命活動中起到了關(guān)鍵信號分子的角色［8］。而Akt 作為其下游主要目標(biāo)蛋白之一，PI3K 活化后，在相關(guān)酶的作用下，通過與相應(yīng)的結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，Akt 磷酸化后被激活引起一系列的細(xì)胞生存、代謝、凋亡等生命活動，因此Akt 磷酸化是衡量PI3K 活化水平的主要指標(biāo)之一［9］。PI3K/Akt 信號活化后，其首要的功能就是激活NF-κB，并誘導(dǎo)其釋放大量的炎性因子，有報道表明其可因此能參與促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1 等的釋放，并誘導(dǎo)結(jié)腸炎的發(fā)病，在炎癥狀態(tài)下能使腸上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡、增殖、癌變等［10-12］。黃曉麗等［13］在療效明確的基礎(chǔ)上，通過觀察PI3K/Akt 信號通路抑制劑對結(jié)腸炎黏膜ρ-Akt 蛋白表達(dá)的影響，與未有抑制劑處理的模型組比較發(fā)現(xiàn)抑制劑處理后結(jié)腸黏膜ρ-Akt 蛋白量表達(dá)降低，說明PI3K/Akt 信號通路抑制劑可以緩解結(jié)腸黏膜的損傷，減輕炎癥反應(yīng)。Larmonier 等［14］在研究姜黃素對結(jié)腸炎小鼠起到保護(hù)作用的機(jī)制發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制PI3K/Akt 信號通路，使PI3K 活性水平降低并抑制Akt 的活化，降低黏膜中性粒細(xì)胞的浸潤而達(dá)到治療結(jié)腸炎的目的。這些都提示阻斷PI3K/Akt 信號可以達(dá)到緩解結(jié)腸黏膜損傷的作用。本研究表明TNBS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜中PI3K 和ρ-Akt 蛋白水平明顯升高，說明在大鼠結(jié)腸炎模型的結(jié)腸黏膜中，PI3K 已被活化，Akt 磷酸化顯著，提示PI3K/Akt 信號通路被激活。而經(jīng)黃芪多糖治療后ρ-Akt、PI3K 蛋白表達(dá)降低，表明黃芪多糖可抑制PI3K 表達(dá)，抑制ρ-Akt 活化，進(jìn)而提示黃芪多糖治療急性潰瘍性結(jié)腸炎的可能機(jī)制是通過抑制PI3K/Akt 信號途徑，減輕炎性損傷來實現(xiàn)。當(dāng)然，PI3K/Akt 信號上下游的物質(zhì)和影響物質(zhì)是非常復(fù)雜的，黃芪多糖抑制PI3K/Akt 信號后進(jìn)一步從何種角度繼續(xù)發(fā)生作用，其最終靶目標(biāo)是什么，還有待于進(jìn)一步深入研究。

［1］ Matsuoka T，Yashiro M. The role of PI3K/Akt/mTOR signaling in gastric carcinoma［J］. Cancers，2014，6 (3):1441-1463.

［2］ Hennessy B T，Smith D L，Ram P T，et al. Exploiting the PI3K/AKT pathway for cancer drug discovery［J］. Nat Rev Drug Discov，2005，4(12):988-1004.

［3］ 成慧娟，呂小平. PI3K-AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與炎癥性腸病關(guān)系的研究進(jìn)展［J］. 廣東醫(yī)藥，2014，35(2):297-299.

［4］ 郭 艷，石 定，萬櫥根，等. 實驗性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠外周血Th17 細(xì)胞的變化及黃芪多糖對其的影響［J］. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32(9):2265-2267.

［5］ Segain J P，Raingeard de la Blétière D，Sauzeau V，et al. Rho kinase blockade prevents inflammation via nuclear factor kappa B inhibition:evidence in Crohn's disease and experimental colitis［J］. Gastroenterology，2003，124(5):1180-1187.

［6］ Butzner J D，Parmar R，Bell C J，et al. Butyrate enema therapy stimulates mucosal repair in experimental colitis in the rat［J］. Gut，1996，38(4):568-573.

［7］ 劉端勇，黃小英，程紹民，等. 四神丸對實驗性結(jié)腸炎結(jié)腸組織Bax/Bcl-2mRNA，F(xiàn)as/Fasl 的調(diào)控作用［J］. 中國中藥雜志，2011，36(24):3484-3488.

［8］ 潘 澎，劉紹能. PI3K/Akt 信號通路與肝纖維化［J］. 臨床肝膽病雜志，2013，29(5):389-396.

［9］ 黃曉麗，鄭玉霞，廖再波，等. 磷脂酰肌醇3 激酶信號傳導(dǎo)通路在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病中的作用［J］. 四川大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2008，39(3):364-367.

［10］ 張 蒙，甘華田. PI3K/AKT 信號傳導(dǎo)通路與腸道炎癥［J］. 華西醫(yī)藥，2006，21(1):192-193.

［11］ 黃曉麗，廖再波，甘華田. 連接腸道炎癥和腫瘤的橋梁-磷脂酰肌醇-3 激酶/AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用［J］. 胃腸病學(xué)，2006，11(11):693-696.

［12］ 張 濤，黃會云，曹火留，等. PI3K-Akt/mTOR 通路調(diào)控P-β-catenin 介導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)癌變及健脾清熱活血方防治研究［J］. 時珍國醫(yī)國藥，2013，24(8):2039-2041.

［13］ 黃曉麗，甘華田，郝清華. 磷脂酰肌醇3 激酶/Akt 在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)［J］. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，35(9):1733-1735.

［14］ Larmonier C B，Midura-Kiela M T，Ramalingam R，et al. Modulation of neutrophil motility by curcumin:implications for inflammatory bowel disease［J］. Inflamm Bowel Dis，2011，17(2):503-515.