胡云飛， 吳德玲， 徐國兵，2* ， 徐 倩， 蔣 磊，3， 吳 虹

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230031;2. 安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥230051;3. 安徽省亳州市食品藥品檢驗中心，安徽 亳州236800)

牡丹皮Moutan Cortex 為毛茛科植物牡丹Paeonia saffruticosa 的干燥根皮，是安徽省道地藥材之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，具有清熱涼血，活血散瘀之功效。牡丹在我國具有悠久的藥用和栽培歷史，其花被選為國花，因該植物產(chǎn)地及加工方法的不同，形成了道地藥材與一般藥材，如鳳丹皮、瑤丹皮、川丹皮、西丹皮、黃丹皮等，而且根據(jù)加工方式，它又可被分為刮丹皮與原丹皮［1-3］。國內(nèi)外對牡丹皮藥理作用的研究較多［4］，但對不同產(chǎn)地該植物的GC-MS 比較分析卻鮮有報道，本實驗采用GC-MS 聯(lián)用技術(shù)，對銅陵、亳州、墊江、運城、嘉興這5 個產(chǎn)地的牡丹皮提取物進(jìn)行分析，從而比較道地藥材與非道地藥材的差異性。

主成分分析 (principal components analysis，PCA)是目前應(yīng)用比較廣泛的化學(xué)計量方法，因其能簡化數(shù)據(jù)，故可快速實現(xiàn)模式化關(guān)系的可視化識別，被廣泛運用于現(xiàn)代中藥復(fù)雜體系的分析［5-11］。另外，偏最小二乘辨別分析(partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA)是一種基于PLS 回歸的辨別分析分類方法，具有高效的鑒別能力。因此，運用PCA 與PLS-DA 對GC-MS 實驗結(jié)果作進(jìn)一步驗證，可為牡丹皮藥材的質(zhì)量評價與道地藥材的鑒別提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 Bruker 450 GC-320 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括CTC 全自動進(jìn)樣器、MS Workstation 色譜工作站(德國Bruker 公司);DB-5 色譜柱(美國HP 公司);NIST 05 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(德國Bruker 公司);S30H-D78224 超聲清洗器(德國Elma Sonic 公司);AL204 分析天平(0.001 g，瑞士Mettler-Toledo 公司);FD115 電熱干燥箱(德國Binder 公司)。

1.2 試劑與材料 甲醇為色譜純(美國Tedia 公司)，使用前經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過;其他試劑均為分析純。牡丹皮藥材分別采自銅陵、亳州、墊江、運城、嘉興，均為三年生，經(jīng)安徽省食品藥品檢驗研究院黃麗丹主任中藥師鑒定，均為毛茛科植物牡丹Paeonia saffruticosa Andr 的根皮。各產(chǎn)地藥材按照《中國藥典》2010 年版［12］方法統(tǒng)一制備，具體信息見表1。

表1 牡丹皮樣品來源Tab.1 Resoures of samples of Moutan Cortex

1.3 實驗條件

1.3.1 提取方法 取鮮牡丹皮適量，去除雜質(zhì)后洗凈，晾至外表面無水分，再去除木心部，40 ℃下烘干，制備成牡丹皮飲片。然后，精密稱取其中1.0 g，加入甲醇10 mL，超聲提取，過濾，定容至10 mL 量瓶中，搖勻，再用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2 色譜條件 DB-5 色譜柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm);進(jìn)樣口溫度250 ℃，升溫程序為起始溫度80 ℃，2 ℃/min 速率升至160 ℃，保持2 min，10 ℃/min 速率升至260 ℃，保持2 min;載氣為高純氦氣;體積流量1.0 mL/min;分流比5 ∶1;進(jìn)樣量1 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜接口溫度250 ℃;EI 離子源，溫度200 ℃;電子轟擊電壓70 eV;全離子掃描，掃描范圍(m/z)33 ～350;采集延時2 min;圖譜采集時間52.0 min。歸一化法計算含有量。

2 結(jié)果

按照“1.3.1”至“1.3.3”項下方法和條件，分別對牡丹皮進(jìn)行提取分析，得到總離子流圖，見圖1。然后，通過檢索NIST 05 數(shù)據(jù)庫，以匹配度大于750 為篩選依據(jù)［13］，初步鑒定了其中41 個揮發(fā)性成分，并通過面積歸一化法計算各成分的相對百分含有量，結(jié)果見表1。

表1 牡丹皮提取物揮發(fā)性成分Tab.1 Volatile constituents of Moutan Cortex extract

3 討論

3.1 GC-MS 分析牡丹皮提取物的化學(xué)成分及相對含有量 本實驗采用GC-MS 聯(lián)用技術(shù)測定牡丹皮提取物的化學(xué)成分，結(jié)果從5 個產(chǎn)地的藥材中鑒別出41 個成分，其中共有成分21 個，見圖1。由圖可知，這些成分主要為芳香族和脂肪酸類化合物，占總量的80%以上，其中丹皮酚、苯甲酸、鄰苯三酚的含有量最高。以丹皮酚為例，5 個產(chǎn)地的相對含有量分別為26.61%、31.59%、25.25%、32.80%、27.79%，說明不同產(chǎn)地的牡丹皮提取物在主要成分的含有量上存在一定差異。另外，銅陵產(chǎn)丹皮(又稱“鳳丹”)與其他產(chǎn)地相比，存在2-furanmenthanol，tetrahydro-5-methyl-trans-(6 號峰)、油酸(30 號峰)等特征峰，可能是其作為道地藥材，在化學(xué)成分種類上的差異。

圖1 顯示，保留時間9.56 min (A)處為苯甲酸與苯甲?；旌衔?，表現(xiàn)為鋸型峰;保留時間19.78 min (B)處為沒食子酰類化合物，表現(xiàn)為拖尾峰，由于GC-MS 的局限性，故需HPLC 等檢測方法作進(jìn)一步分離。這兩類化合物的相對含有量分別達(dá)到24.30%和14.73%，與文獻(xiàn)［14-15］關(guān)于牡丹皮中含有大量沒食子酰葡萄糖類和苯甲酰類化合物的報道一致。

圖1 牡丹皮藥材的GC-MS 總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatograms of Moutan Cortex

3.2 PCA 與PLS-DA 對結(jié)果的驗證

3.2.1 PCA 對結(jié)果的驗證 將各產(chǎn)地牡丹皮藥材的數(shù)據(jù)(各5 個樣本)導(dǎo)入SIMCA-P 11.0 版，以樣本成分的峰面積為特征值，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析(PCA)和有監(jiān)督的偏最小二乘辨別分析(PLS-DA)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前兩個組分貢獻(xiàn)的總方差為78.8%，見圖2。由圖可知，5 個產(chǎn)地的藥材在主成分空間的分布上較分散，各產(chǎn)地樣本均處于相對獨立的空間，得到了有效區(qū)分，說明不同產(chǎn)地的藥材提取物有著一定程度上的區(qū)別。另外，從疏密度方面來看，銅陵和亳州產(chǎn)相對較為集中，而嘉興和運城產(chǎn)較為分散，可能是由于受地理、氣候等因素影響，其化學(xué)成分的富集也有所不同，地理分布越接近的居群，其主成分空間的分布位置也越接近，這種分布上的差異也驗證了GCMS 的分析結(jié)果。

圖2 不同產(chǎn)地牡丹皮的PCA 得分圖Fig.2 PCA score plot of Moutan Cortex from different regions

3.2.2 PLS-DA 對結(jié)果的驗證 在PCA 分組的基礎(chǔ)上，本實驗進(jìn)一步作有監(jiān)督的PLS-DA 辨別分析，結(jié)果識別模型的解釋度(R2Y)為72.5%，模型的預(yù)測度(Q2Y)為67.5%，故可認(rèn)為各成分含有量的R2X 為78.7%。然后，對牡丹皮進(jìn)行分組比較，見圖3，再按變量對分組的貢獻(xiàn)率(VIP)大小進(jìn)行排序，見圖4。其中，2-氨基乙醇、2-methyl-Z，Z-3，13-octadecadienol、丁腈，2，3-二氧-，二肟，O，O'-二乙酰、(1，1'-bicyclopropyl)-2-octanoic acid，2'-hexyl-，methyl ester (-)、3-乙氧基苯甲酸的VIP 均＞1.2，表明這幾個組分為不同產(chǎn)地分組的主要生物標(biāo)記物，即以上5 種成分在不同產(chǎn)地藥材的富集中具有一定差異性。

圖3 不同產(chǎn)地牡丹皮藥材的PLS-DA 得分圖Fig.3 PLS-DA score plot of Moutan Cortex from different regions

圖4 各變量對分組的貢獻(xiàn)值(VIP)Fig.4 Contribution values of each variable to grouping(VIP)

［1］ 陳悅嬌，陳杰林，馬應(yīng)丹. 丹皮揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析［J］. 廣州食品工業(yè)科技，2002，18(4):36-37.

［2］ 曲家妮，姜興濤，肖海鴻，等. 丹皮提取物的SPME-GC/MS 分析［J］. 煙草科技，2012(6):45-47.

［3］ 孫 強(qiáng)，李梅青，吳 悠，等. 兩種鳳丹鮮花揮發(fā)性成分的HS/SPME/GC/MS 分析［J］. 光譜實驗室，2013，30(1):145-150.

［4］ 胡云飛，徐國兵. 牡丹皮及其主要成分丹皮酚的藥理作用研究進(jìn)展［J］. 安徽醫(yī)藥，2014，18(4):589-592.

［5］ 田洪磊，張 灝，田豐偉，等. GC-MS 結(jié)合聚類分析和PCA 分析用于新疆小白杏杏仁油質(zhì)量控制研究［J］. 食品工業(yè)科技，2013，34(2):87-90.

［6］ 夏愛軍，李 玲，董 昕，等. GC-MS 結(jié)合主成分分析法對不同產(chǎn)地旱蓮草藥材揮發(fā)性成分的比較分析［J］. 解放軍藥學(xué)學(xué)報，2013，29(2):109-111，124.

［7］ 葉 楠，肖作兵，劉 強(qiáng)，等. 氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)合主成分分析辨別卷煙基本味覺的研究［J］. 食品工業(yè)科技，2012，33(5):76-79.

［8］ 李 玲，呂 磊，張 薇，等. 運用GC-MS 結(jié)合PCA 技術(shù)對川白芷與杭白芷揮發(fā)油成分的比較分析［J］. 藥物分析雜志，2011，31(1):112-118.

［9］ 李海祥，唐志榮，李維芳，等. 基于GC-MS 的天然綠色棉乙醇提取物主要成分分析［J］. 紡織學(xué)報，2012，33(7):8-11.

［10］ 鐘科軍，魏萬之，郭方遒，等. GC-MS 及主成分分析法用于咖啡香精的指紋圖譜分析和微差樣品的識別［J］. 分析試驗室，2006，25(8):119-122.

［11］ 王淳浩，王彥吉，孟品佳，等. 應(yīng)用主成分分析SPME/GC-MS 法鑒別人體氣味的研究［J］. 分析測試學(xué)報，2008，27(5):488-492.

［12］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:160-161.

［13］ 徐國兵，張亞中，韓玲玲，等. 前胡超臨界CO2流體提取物及揮發(fā)油的GC-MS 分析［J］. 中成藥，2010，32(6):988-991.

［14］ He C N，Peng B，Dan Y，et al. Chemical taxonomy of tree peony species from China based on root cortex metabolic fingerprinting［J］. Phytochemistry，2014，107:69-79.

［15］ 許舜軍，楊 柳，張 勉，等. 牡丹皮化學(xué)成分的液相色譜-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜分析［J］. 藥學(xué)學(xué)報，2006，41(9):852-856.