詹羽姣， 盛 萍 ， 姚 藍(lán)， 史 紅， 張 煊

(新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830011)

伊貝母為百合科植物新疆貝母Fritillaria walujewii Regel 或伊犁貝母Fritillaria pallidiflora Schrenk的干燥鱗莖，具有清熱潤(rùn)肺，化痰止咳之功效，收載于《中國(guó)藥典》歷屆版本中［1］。其與川貝母功效相同，臨床上常用于治療肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛勞咳、咳痰帶血等癥。伊貝母野生品種僅分布于我國(guó)新疆，為國(guó)家三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生藥材［2-3］，由于該植物資源破壞嚴(yán)重，因此為滿足市場(chǎng)需求，60 年代起新疆開展伊貝母資源野生品變家種實(shí)驗(yàn)，70 年代成功引種并大量投入醫(yī)藥市場(chǎng)。目前，新疆藥材市場(chǎng)上流通的伊貝母多為境內(nèi)鞏留縣、新源縣、霍城縣、溫泉縣等地的人工栽培品，但新疆地形多變，獨(dú)特的自然條件對(duì)該植物的種間變異和種質(zhì)資源有很大影響［4］。所以，對(duì)伊貝母野生品與栽培品的種質(zhì)資源進(jìn)行考察，將給科學(xué)合理地開發(fā)、利用及保護(hù)該植物，并保證其臨床用藥療效帶來(lái)重大意義。

簡(jiǎn)單重復(fù)區(qū)間序列(ISSR)是一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定及遺傳多樣性分析等研究中［5-6］。目前，應(yīng)用該技術(shù)對(duì)貝母屬藥用植物川貝母、浙貝母、平貝母的種質(zhì)資源遺傳多樣性研究較多［7-12］，但對(duì)伊貝母這一方面的研究尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)新疆不同產(chǎn)地伊貝母的16 個(gè)野生和栽培居群，共128 份樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，計(jì)劃從DNA 分子水平探討該植物的群體遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性水平，了解其野生和栽培品種遺傳純度，保證其臨床療效，為伊貝母種質(zhì)資源的綜合評(píng)價(jià)、合理利用及品種保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料 藥材于2012 年5 月—6 月采集于新疆省不同產(chǎn)地，每個(gè)產(chǎn)地隨機(jī)選取樣品植株，采集其幼嫩葉，置于硅膠袋中迅速干燥，保存于-20 ℃冰箱中備用，樣品信息見表1。經(jīng)鑒定，它們均為百合科植物新疆貝母F. walujewii Regel 或伊犁貝母F. pallidiflora Schrenk 的干燥鱗莖，標(biāo)本保存于新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥資源教研室。

Plant Genomic DNA Kit 植物基因組DNA 提取試劑盒(離心柱型)、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、Mg2+、10 × Buffer、2000kb DNA Marker、Gelview(天根生化科技北京有限公司);引物(上海生工有限公司，根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的第9 套ISSR 引物序列合成)。

1.2 儀器 Anke TGL-16C 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);DYY-7C 電泳儀 (北京六一儀器廠);Bio-Rad C1000 PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad 公司);瓊脂糖凝膠成像儀(上海培清科技有限公司)。

表1 不同居群伊貝母種質(zhì)信息Tab.1 Information of different populations of Yibeimu

2 方法

2.1 基因組總DNA 提取 課題組前期已對(duì)伊貝母的總DNA 提取方法 (改良的CTAB 法、改良的SDS 法與試劑盒法)進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)試劑盒法為最佳方法。因此，本實(shí)驗(yàn)采用Plant Genomic DNA Kit 試劑盒(離心柱型)提取植物基因組的DNA，操作步驟參照說(shuō)明書。然后，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 完整性，核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)其濃度及純度，并將總DNA 質(zhì)量濃度稀釋至50 ng/μL，保存于4 ℃冰箱備用。

2.2 擴(kuò)增與成像 采用優(yōu)化的伊貝母ISSR-PCR體系，對(duì)74 條引物進(jìn)行篩選，得到15 條條帶清晰、多態(tài)性豐富且重復(fù)性較好者用于PCR 擴(kuò)增。其ISSR-PCR 最適體系(50 μL)為Mg2+2.50 mmol/L、dNTPs 0.30 mmol/L、Primer 0.80 μmol/L、Taq DNA 聚合酶0.75 U、模板DNA 1.00 ng/μL、10 ×Buffer 5 μL、ddH2O 33.4 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性7 min，變性30 s，退火(根據(jù)引物不同設(shè)定溫度)45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)45 次，72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。然后，Gelview 染色擴(kuò)增產(chǎn)物，DL2000 DNA Marker 作相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，2%瓊脂糖凝膠于115 V 電壓下電泳50 min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察，并拍照分析。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 每份材料的電泳結(jié)果采用0/1 賦值記帶，ISSR 分子標(biāo)記為顯性標(biāo)記，有條帶(包括強(qiáng)帶和弱帶)者記為“1”，無(wú)條帶者記為“0”，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后記錄于Excel 表格中。接著，Popgene32 軟件對(duì)所統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的參數(shù)。最后，NTSYS-PC 軟件進(jìn)行聚類分析，采用SHAN 程序構(gòu)建聚類圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 ISSR 擴(kuò)增結(jié)果 74 條引物中篩選出15 條條帶清晰、多態(tài)性較好者，對(duì)128 份伊貝母進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，用于分析其不同居群的多態(tài)性，結(jié)果電泳產(chǎn)生了清晰條帶，部分引物的擴(kuò)增圖譜見圖1。而且，15條引物共檢測(cè)出239 條條帶，其中多態(tài)性位點(diǎn)227 個(gè)，相對(duì)分子質(zhì)量大多在200 ～1 600 bp 之間，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為94.98%，見表2。

圖1 部分引物對(duì)部分伊貝母樣品的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of a part of primers for some samples of Yibeimu

表2 伊貝母ISSR 擴(kuò)增結(jié)果和多態(tài)性分析Tab.2 ISSR amplification result and polymorphism analysis of Yibeimu

3.2 伊貝母植物居群間的遺傳多樣性 采用Popgene32 軟件，對(duì)伊貝母16 個(gè)居群的128 份樣品進(jìn)行分析，見表3。結(jié)果顯示，該植物不同居群間各自的多態(tài)性位點(diǎn)百分率 (PPB)在22.59%～53.56%之間，其中吉木薩爾縣大有鄉(xiāng)野生居群的PPB 最高(53.56%)，而新源縣那拉提栽培居群的最低(22.59%)。16 個(gè)伊貝母居群的等位基因數(shù)(Na)為1.949 8 ±0.218 8，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.342 6 ± 0.309 9，Nei’s 多樣性指數(shù)(H)為0.219 0 ±0.160 3，Shannon’s 信息指數(shù)(I)為0.350 3 ±0.217 0，表明其資源在DNA 分子整體水平上有較高的遺傳多樣性。

表3 伊貝母16 個(gè)居群的遺傳多樣性Tab.3 Genetic diversities of 16 populations of Yibeimu

3.3 伊貝母不同居群的遺傳分化 由伊貝母16 個(gè)居群之間的遺傳分化水平可知，其總基因多樣度(Ht)為0.222 7 ±0.026 6，遺傳多樣度(Hs)為0.104 6 ±0.005 5，居群間的遺傳分化指數(shù)(Gst)為0.530 4，即在總遺傳變異中有53.04%存在于居群間，46.96%存在于居群內(nèi)，顯示出遺傳多樣性變異大多存在于居群間。另外，基因流(Nm*)為0.442 7，表明居群間的基因交流程度比較有限。

3.4 伊貝母植物的聚類分析和親緣關(guān)系 采用NTSYS-PC 軟件和UPGMA 法，并根據(jù)Nei’s 遺傳距離，對(duì)128 份伊貝母進(jìn)行聚類分析，見圖2。由圖可知，種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)在0.69 ～0.95之間，并且在GS =0.69 處，可將伊貝母明顯分為兩大類，P1 ～P10 為第一大類 (新疆貝母);P11 ～P16 為第二大類 (伊犁貝母)。另外，在GS=0.71 處，又可將新疆貝母分為兩組，米泉林場(chǎng)哈熊溝、吉木薩爾大有鄉(xiāng)、木壘縣照壁山的7 份野生種質(zhì)樣品為第一組;木壘縣照壁山的3份野生種質(zhì)樣品與奇臺(tái)縣吉布庫(kù)水電站、呼圖壁雀兒溝、瑪納斯清水河、沙灣林場(chǎng)、烏蘇白楊溝、烏蘇巴音溝的所有野生種質(zhì)樣品和新源縣那拉提的所有8 份栽培種質(zhì)樣品為第二組。由此可知，新疆貝母野生與栽培種質(zhì)資源遺傳多樣性水平的相似性較高。另外，在GS=0.774 處，可將伊犁貝母分為兩組，霍城縣果子溝、伊犁賽里木湖、溫泉邊防哨所、霍城縣蘆草溝的所有野生種質(zhì)樣品及7 份栽培種質(zhì)樣品為第一組;霍城縣蘆草溝的3 份栽培種質(zhì)與鞏留縣莫乎爾鄉(xiāng)、新源縣那拉提的所有栽培種質(zhì)樣品為第二組，這也表明伊犁貝母野生與栽培種質(zhì)資源遺傳多樣性水平的相似性較高。

由遺傳相似性可看出，所采集的伊貝母具有較高的遺傳多樣性，被分成的兩大類(新疆貝母和伊犁貝母)也正與其品種來(lái)源相符。圖2 顯示，新疆貝母中的77 ～84 號(hào)樣品聚為一類，為栽培品種;70 ～76 號(hào)樣品聚為一類，為野生品種;70 ～84 號(hào)樣品，即野生與栽培品種，又可共聚為一類。伊犁貝母中的97 ～100 號(hào)樣品聚為一類，為野生品種;101 ～107 號(hào)樣品聚為一類，為栽培品種;97 ～107 號(hào)樣品，即野生與栽培品種，又可共聚為一類。綜上所述，新疆貝母和伊犁貝母的野生與栽培品種均可分別聚為一類，而且無(wú)明顯差異。

圖2 128 份伊貝母樣品基于ISSR 分析的UPGMA 聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 128 Yibeimu samples based on ISSR analysis

為了進(jìn)一步分析伊貝母居群間的遺傳分化程度，本實(shí)驗(yàn)計(jì)算了其Nei’s 遺傳一致度(I)和遺傳距離(D)，見表4。結(jié)果顯示，16 個(gè)伊貝母居群間I 的變化范圍在0.734 4 ～0.966 6 之間，而D在0.034 0 ～0.308 8 之間，表明吉木薩爾大有鄉(xiāng)(新疆貝母野生品)與木壘縣照壁山(新疆貝母野生品)的遺傳一致度最高(0.966 6)，遺傳距離最小(0.034 0)，即兩者的遺傳差異較小，親緣關(guān)系最近;沙灣林場(chǎng)(新疆貝母野生品)與溫泉邊防哨所(伊犁貝母野生品)的遺傳一致度最低(0.734 4)，遺傳距離最大(0.308 8)，即兩者的遺傳差異較大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，提示地理位置的遠(yuǎn)近對(duì)遺傳一致度和遺傳差異也有較大影響。

4 討論

4.1 伊貝母的遺傳多樣性水平及遺傳分化 本實(shí)驗(yàn)對(duì)16 個(gè)居群128 份伊貝母的ISSR 遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其代表性較好，種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性，而且栽培品種的遺傳純度與野生品種接近，這可能與目前該植物的合理引種栽培與野生種質(zhì)資源保護(hù)密切相關(guān)。另外，由伊貝母16 個(gè)居群之間的遺傳分化水平顯示，其總遺傳變異中有53.04%存在于居群間，而余下的46.96%存在于居群內(nèi)，基因流(Nm*)為0.442 7，表明居群間的基因交流程度比較有限，存在遺傳分化。

表4 伊貝母16 個(gè)居群遺傳一致度(I，對(duì)角線以上)和遺傳距離(D，對(duì)角線以下)Tab.4 Genetic similarity coefficients (I，above diagonal)and genetic distance (D，below diagonal)in 16 populations of Yibeimu

4.2 伊貝母的聚類分析及遺傳距離 根據(jù)Nei’s遺傳距離得到的聚類圖可知，各種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)介于0.69 ～0.95 之間，128 份樣品被明顯分為兩大類，恰好與其品種來(lái)源(新疆貝母和伊犁貝母)相符，并未根據(jù)野生和栽培樣品聚類，也未完全按照地區(qū)聚類，說(shuō)明伊貝母的野生與栽培品種之間無(wú)明顯差異。而且，I 和D 的分析結(jié)果顯示，野生新疆貝母之間的遺傳差異較小，而野生新疆貝母與伊犁貝母之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，提示地理位置的遠(yuǎn)近對(duì)遺傳一致度和遺傳差異有較大影響。

4.3 伊貝母種質(zhì)資源評(píng)價(jià) 本實(shí)驗(yàn)采用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)，從分子水平上研究伊貝母的種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性水平。結(jié)果表明，該植物在總體上具有較豐富的遺傳多樣性，能適應(yīng)環(huán)境的變化。目前，大部分伊貝母栽培品種的遺傳純度已很高，可保證其藥材質(zhì)量和臨床療效，并為該植物種質(zhì)資源的綜合評(píng)價(jià)、合理利用及品種保護(hù)提供了科學(xué)依據(jù)。

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